Pax-8基因在心脏发育中蛋白表达下调.doc

1、Pax-8 基因在心脏发育中蛋白表达下调作者：倪秋明，章佳颖，来丹丹，褚茂平，王赛斌，黄晓燕，张怀勤，杨德业【摘要】 目的:观察 Pax-8 基因在 ALK3 基因敲除小鼠心脏中的蛋白表达情况，探讨 Pax-8 基因在心脏发育中的作用。方法:基因芯片(microarray)和定量逆转录-聚合酶链反应测定 ALK3 基因的下游基因，免疫组化法检测 13.5 d 小鼠胚胎心脏特异性 ALK3 基因敲除小鼠胚胎中Pax-8 蛋白的表达，连续病理切片及 HE 染色观察刚出生的 Pax-8 基因敲除小鼠的心脏形态。结果：在心脏特异的 ALK3 基因敲除小鼠中，转录因子 Pax-8 基因 mRNA 的表达

2、水平上被下调 7.1 倍。免疫组化结果显示：13.5 d 小鼠胚胎心脏特异性 ALK3 基因敲除的纯合子小鼠 Pax-8 基因在蛋白水平与杂合子相比也明显下调。Pax-8 基因敲除小鼠纯合子有明显的室间隔和左心室肥厚，心脏呈球形。结论:Pax-8 基因是 ALK3 基因的下游基因，与心脏发育有密切关系。 【关键词】 Pax-8 基因；室间隔缺损；免疫组化；蛋白表达Abstract: Objective: To investigate the level of Pax-8 protein expression in the condi-tional ALK3 kockout mice heart

3、 and study the role of Pax-8 gene in the cardiac development. Methods: The microarray and real time quantitative RT-PCR were used to investigate the down-stream genes of ALK3. Immunohistochemical technology was used to detect the level of Pax-8 protein expression in the 13.5 d heart derived from a-M

4、HC Cre+/-，ALK3 F/- and a-MHC Cre+/-，ALK3 F/+ mice. To study the contribution of Pax-8 gene in the cardiac development，the heart derived from pax-8 kockout mice was overviewed using consecutive pathological section and HE staining method. Results:The level of Pax-8 mRNA expression was down-regulated

5、7.1 fold in the embryonic heart (11.5 days) of a-MHC Cre+/-，ALK3 F/-. The level of Pax-8 protein expression was also remarkably down-regulated in the embryonic heart (13.5 days) of a-MHC Cre+/-，ALK3 F/-. The heart of pax-8 KO-/-mice became spheroidal，the left ventricle enlarged， left ventricular wal

6、l and interventricular septum thickened， papillary muscles in the left ventricle enlarged. Conclusion: Pax-8 gene is the cardiac-specific ALK3 downstream gene. Pax-8 may play important roles in the cardiac development.Key words: Pax-8 gene；ventricular septal defect；immunohistochemistry ；protein expr

7、ession先天性室间隔缺损的发病机制尚不十分清楚。近年来，美国Schneider 教授使用 a-MHC Cre+loxP 系统1(心脏特异性敲除系统)对心脏 ALK3 基因进行特异性地敲除，ALK3 基因敲除的纯合子小鼠死于胚胎中期，并有室间隔缺损、心内膜垫和肌小梁发育不良2。然而，ALK3 基因是与心脏发育有关的比较上游的基因。为了研究 ALK3 下游的并有心脏特异性的基因，在 ALK3 基因敲除和 Pax-8 基因敲除小鼠模型上，观察 Pax-8 基因在心脏中的蛋白表达情况，以探讨 Pax-8 基因在心脏发育中的作用。1 材料和方法1.1 动物 20 只 a-MHC Cre +/-、AL

8、K3+/-（a- MHC 为启动子的Cre 重组酶转基因杂合子，ALK3 系统基因敲除的杂合子小鼠）和 20 只ALK3 F/F（在 ALK3 基因第 2 个外显子两端插入 lox P 序列的小鼠）的C57 小鼠(由美国 Schneider 教授提供)交配，可得到在心脏纯合子 ALK3基因敲除(a-MHC Cre +/-、ALK3 F/-)的小鼠胚胎和杂合子 ALK3 基因敲除(a-MHC Cre +/-、ALK3 F/)的胚胎。 Pax-8 基因敲除的纯合子小鼠(Pax-8 KO -/-)和 Pax-8 基因敲除的杂合子小鼠(Pax-8 KO +/-)由德国Gruss 和 Mansouri

9、教授惠赠。1.2 总 RNA 的提取 首先收集试验组和对照组的 11.5 d 小鼠的胚胎心脏，然后用总 RNA 试剂盒（美国 QIAGEN 公司生产）提取和纯化总RNA。1.3 基因芯片3 德国生产的 25 000 个小鼠基因的基因芯片被用于比较两组 11.5 d 小鼠胚胎心脏总 RNA。 试验组的总 RNA 来自 a-MHC Cre +/-、ALK3 F/-的 11.5 d 小鼠胚胎心脏，对照组的总 RNA 来自 a-MHC Cre +/-、ALK3 F/+ 的 11.5 d 小鼠胚胎心脏。1.4 定量逆转录-聚合酶链反应4 Taq Man 一步法聚合酶链反应试剂盒(美国 Perkin-El

10、mer 公司生产)被用于定量 RT-PCR。每个 PCR 反应孔使用 100 ng 的总 RNA。试验组的 RNA 来自 a-MHC Cre +/-、ALK3 F/-的 11.5 d 小鼠胚胎心脏，对照组的 RNA 来自 a-MHC Cre +/-、ALK3 F/+的 11.5 d 小鼠胚胎心脏。 cDNA 合成的条件是 48 、30 min。cDNA经过 40 个 PCR 周期被扩增。在 PCR 扩增前首先用 95 、10 min 使 cDNA变性。每个 PCR 周期由 95 、15 s（变性）加上 60 、1 s（退火+延伸） 。每种 RNA 同时做 3 个条件完全相同的 PCR 反应孔。

11、所有 PCR 有效性在 95%以上。ABI PRISM 7700 序列检测仪(美国 Perkin-Elmer 公司生产)被用于定量 RT-PCR 的检测。转录因子 Pax-8 的荧光素探针序列是：6 FAM-TGT CCC CAG TGT CAG CTC CAT CAA CA-TAMRA。Pax-8 的正向引物序列是：5-CAG AAG GCG TTT GTG ACA ATG A- 3。Pax-8 的逆向引物序列是：5-GCA CTT-TGG TCC GGA TGA TT-3。定量 RT-PCR 内部对照基因 36B4 的荧光素探针序列是：6FAM-CCA GGC TTT GGG CAT CA

12、C CAC G-TAMRA。36B4 的正向引物序列是：5-GGA CCC GAG AAG ACC TCC TT-3 。36B4 逆向引物序列是：5-TCA ATG GTG CCT CTG GAG ATT-3 。1.5 免疫组化染色 试验分 A、B、C、D 四组，A 组(试验组)为a-MHC Cre +/-、ALK3 F/-(纯合子)小鼠胚胎 6 只，B 组(对照组)为 a-MHC Cre +/-、 ALK3 F/+(杂合子)的小鼠胚胎 6 只，C 组(阴性对照组)为 Pax-8 KO -/-(纯合子)6 只，D 组(阳性对照组)为刚出生正常 C57 小鼠6 只。取 13.5 d a-MHC

13、Cre +/-、ALK3 F/-(纯合子)和 a-MHC Cre +/-、ALK3 F/+(杂合子)以及 13.5 d 的 Pax-8 KO-/-（纯合子）的小鼠胚胎心脏，刚出生 C57 小鼠取甲状腺组织。免疫组化采用 SABC 法，具体步骤参照免疫组化试剂盒（Proteintech 生物技术有限公司生产）说明书。免疫组化染色图片每张切片光镜下放大 400 倍，随机抽取 35 个视野，用Advanced spot 拍照系统进行拍照保存。应用 IPP 分析软件测定图片的累计光密度值（OD 值） 。1.6 HE 染色 试验组为 19.5 d(刚出生)Pax-8 KO -/-(纯合子)的小鼠，对照组

14、为 19.5 d(刚出生)Pax-8 KO +/-(杂合子)的小鼠，按常规做四腔心切片，切片厚度约 3 m，切片用 HE 法染色来观察心脏大体形态。HE 染色图片，在光镜下放大 20 倍，直接观察，拍照。1.7 统计学处理方法 采用 SPSS13.0 统计软件，多组之间均数的两两比较采用 SNK-q 检验。2 结果 2.1 心脏特异 ALK3 基因敲除小鼠的获得 雌的 -MHC Cre +/-、ALK3 +/- 和雄的 ALK3 F/F (在 ALK3 基因第二外显子两边插入 Lox P的片段) 交配可获得 -MHC Cre +/-、ALK3 F/-(纯合子)和 -MHC Cre +/-、AL

15、K3 F/+(杂合子)的小鼠胚胎。2.2 Pax-8 基因敲除小鼠的获得 雌的 Pax-8 KO +/- 和雄的Pax-8 KO +/-交配可获得 Pax-8 KO -/-(纯合子)和 Pax-8 KO +/-(杂合子)。2.3 用基因芯片的方法获得的 ALK3 下游的可能基因 将 25 000个基因在试验组和对照组中的 mRNA 表达水平进行比较，增加或减少两倍以上为阳性。Pax-8 及 Hox-3.5 等 12 个基因在 a-MHC Cre +/-、ALK3 F/-小鼠胚胎心脏中的表达下调，见表 1。Ras 相关蛋白 Rab-5b 及 EPS-8蛋白等 16 个基因在 a-MHC Cre

16、+/-、ALK3 F/-小鼠胚胎心脏中的表达是上调的，见表 2。2.4 定量 RT-PCR 结果 转录因子 Pax-8 基因在 -MHC Cre +/-、ALK3 F/-组小鼠比 -MHC Cre +/-、ALK3 F/+ 组小鼠表达水平低 7.1倍（P 0.01） 。而作为定量 RT-PCR 内部对照的 36B4 基因的表达水平在两组间的差异无显著性。见图 1。2.5 免疫组化染色结果2.5.1 试验组 a-MHC Cre +/-、ALK3 F/-(纯合子)心脏中 Pax-8阳性染色比较少，每个视野下只有少数细胞核呈阳性，被染成棕黄色，而 -MHC Cre +/-、ALK3 F/+(杂合子)

17、心脏对照组每个视野下可见大量阳性细胞，细胞核被染成棕黄色。C57 小鼠甲状腺阳性对照组也可见大量阳性细胞表达，而 Pax-8 KO -/-(纯合子)小鼠阴性对照组心脏未见 DAB染色及阳性细胞表达（见图 2） 。2.5.2 图片分析及统计学处理结果: 四组 Pax-8 免疫组化染色的图像分析数据及其统计分析结果见表 3。2.6 HE 染色结果 Pax-8 KO -/-(纯合子)小鼠，四腔心切片，HE染色，有明显左室肥大及室间隔肥厚，对照组 Pax-8 KO +/-(杂合子)小鼠心脏形态未见明显异常（见图 3） 。3 讨论Pax 基因是编码转录因子的发育控制基因的超家族，它包括 9 个成员，即

18、Pax 195-6。Pax-8 基因是 Pax 基因家族的一个成员，定位于人类染色体 2q12-147-8，在小鼠定位于染色体 2，人和小鼠的 Pax-8基因的保守区域结构特征相似，都编码 128 个氨基酸的成对结构域（PD） 。Pax-8 基因的表达具有组织器官特异性，通过原位杂交方法证实，其mRNA 在发育中的脑、肾、甲状腺及成熟的肾、甲状腺中存在。Pax-8 基因在甲状腺发育中起重要作用。ALK3 基因是心脏发育和室间隔形成的重要基因，小鼠 ALK3 基因心脏特异性敲除后，小鼠出现室间隔缺损、心内膜垫和肌小梁发育不良1。为了研究 ALK3 的下游基因，我们实验室利用基因芯片与 PCR 选

19、择性 cDNA减数法筛选出 Pax-8 及 Hox-3.5 等 12 个基因在 -MHC Cre +/-、ALK3 F/-小鼠胚胎心脏中 mRNA 表达是下调的，其中 Pax-8 基因的表达下降了 7.1倍。原位杂交证实 Pax-8 基因仅表达于 ALK3 基因敲除杂合子的小鼠胚胎心脏，而不见于 ALK3 基因敲除的纯合子。通过免疫组化技术检测 Pax-8基因在 ALK3 基因敲除小鼠心脏的蛋白水平中的表达，从而进一步探讨Pax-8 基因在心脏发育过程中的作用，及其与先天性心脏病的关系。实验证实了 Pax-8 基因在 ALK3 基因敲除纯合子小鼠心脏的室间隔在蛋白水平表达上与杂合子组相比也明显

20、减少，而在 Pax-8 基因敲除的纯合子小鼠未见表达。以上研究表明，心脏特异性 ALK3 基因敲除小鼠的 Pax-8 基因在 mRNA 和蛋白水平上都明显下调，从而可以证明 Pax-8 基因与心脏发育密切相关。通过对 Pax-8 基因敲除小鼠纯合子和杂合子心脏连续病理切片、HE 染色后发现，19.5 d(刚出生)的小鼠心脏表现为室间隔明显肥厚，左心室肥大，形状呈球形。Okuno 研究证明 Pax-8 基因敲除小鼠在生长发育过程中与杂合子相比，个体明显偏小，步态不稳，且死于断乳期9。本实验可以从 mRNA 和蛋白水平方面证实 Pax-8 基因是 ALK3 基因的下游基因，在心脏发育中起了重要的作

21、用。一般来说，越下游的基因组织特异性越强，Pax-8 下游基因是什么还需要进一步的实验研究证实。【参考文献】1 Fukushipe S , Ikoda J. Trapping of mammalian promoters byCre-lox site specific recombinationJ. DNA Res , 1996 , 3(2): 73-80.2 Gaussin V, Van de putte T, Mishina Y, et al. Endocardialcushion and myocardial defects after cardiac myocyte-spe-cific

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