1、成人脂肪来源间充质干细胞的分离培养与鉴定作者：李战强,黄友章,彭勤建,汪立川,解永学,廖丽 【关键词】 脂肪 【关键词】 成人；脂肪；干细胞；分离；培养 1 实验资料 试剂均购自 Sigma 公司，荧光标记单抗购自 BD 公司，DMEM 购自Gibco 公司. 成年女性 48 岁行吸脂术时用无菌针管从臀上方吸取深层脂肪组织 20 mL. 在 1 h 内将其移至离心管内，加入等量 PBS 缓冲液，充分振荡后低速离心 800 r/min10 min. 反复冲洗 3 次后加入等量 15 g/L I 型胶原酶. 37水浴中充分振荡 30 min，再加入等量胎牛血清（FBS）中止. 低速离心 10 mi
2、n 后弃去上清. 将下层细胞用 PBS 悬浮后加入 16 mmol/L NH4Cl 37水浴中 10 min 以裂解红细胞 . 低速离心 10 min 后再用 PBS 冲洗 3 次. 最后将瞎胞用含 100 mL/L FBS+10 g/L 青霉素的 DMEM悬浮后移入培养瓶中，37，50 mL/L CO2 培养箱中孵育，48 h 后首次换液，弃去悬浮细胞. 随后每 3 d 换液，1 wk 后传代. 将第 3 代细胞用于流式细胞仪检测. 浓集细胞到 109/L 后按文献所述方法进行流式细胞仪检测. 细胞传至第 3 代时将其以 2107/L 的细胞数分别转入各定向培养基（表 1）中进行培养. 诱导
3、培养 2 wk 后，对成脂诱导组进行油红脂肪颗粒染色，对成骨诱导组进行碱性磷酸酶组化染色，对成软骨诱导组进行 II 型胶原染色，对成肌诱导组进行肌浆球蛋白组化染色. 结果：观察 2 d 细胞贴壁. 倒置显微镜下见细胞为大而扁平的单层细胞. 有的细胞体细长，似成纤维细胞. 流式细胞仪图上为单一群体细胞. 免疫表型：CD10 69.8%,CD13 99.2%,CD29 91.0%,CD55 81.6%,CD59 98.6%,CD105 98.0%,CD166 32.1%,CD14 0%,CD45 0%,CD34 85.7%,HLADR 0%, 与国外文献一致. 油红染色、碱性磷酸酶染色、II 型胶
4、原染色阳性、肌浆球蛋白染色分别呈阳性.表 1 含 10 g/L 青霉素的定向诱导培养基 DMEM 成份（略） 2 讨论 脂肪来源的干细胞（adipose tissuederived stem cells）虽然具备干细胞的一些特性，但还不能将其称为脂肪干细胞，因为其中可能含有不同分化阶段的脂肪前体细胞（preadipocyte）. 从这个意义上讲，将其称为脂肪基质细胞（adipose tissuederived stromal cells）更为适合1-3. 目前在干细胞研究领域均公认，间充质干细胞没有特异的表面标志. 免疫组化染色和流式细胞仪检测等免疫表型的结果对确认干细胞有辅助作用. 而鉴定干
5、细胞的最好方法是进行多系定向诱导，并进行相应检测以确定诱导成功. 而在一些文献中以偏概全，通过少数几个CD 分子的免疫组化染色的阳性结果而下结论说所分离出的细胞是干细胞是不可取的4-5. 本研究参照 Zuk 等1的方法进行细胞分离培养，并通过免疫表型和功能诱导 2 个方向的实验，取得了与文献相一致的结果，一方面说明此种方法具备稳定的可操作性，另一方面也充分说明所分离培养的脂肪基质细胞中确实含有多向分化潜能的间充质干细胞. 【参考文献】 1 陈希哲，林云锋，乔鞠，等. 人体脂肪基质细胞分离培养及其成骨潜能J. 实用口腔医学杂志，2004,20(1):12-15. 2 余方圆，卢世璧，袁枚，等. 兔脂肪干细胞的分离培养及定向诱导为软骨细胞的实验观察J. 中国临床康复，2004,8(11):2042-2043. 3 刘桂英，杨立业，郑佳坤，等. 来源于脂肪组织的基质细胞向成骨细胞分化J. 实用口腔医学杂志，2003,19(6):554-557. 4 鞠晓东，娄思权，田华，等. 脂肪间充质干细胞的基本生物学特性及向成骨细胞诱导分化的实验研究J. 中华实验外科杂志，2004,21(6):654-656. 5 陈光辉，王燕，李天德，等. 自成人脂肪组织分离与培养间充质干细胞的实验研究J. 解放军医学杂志，2004,29(6):510-512.
