代谢组学在中医证候本质研究中的应用概况.doc

1、代谢组学在中医证候本质研究中的应用概况代谢组学是一门对生物体内所有代谢物进行定量分析，并寻找代谢物与生理病理变化的相对关系，揭示机体生命活动代谢本质的科学，其研究对象大都是相对分子质量 1000 以内的小分子物质。中医证候是通过中医四诊获取的基本信息，概括人体在病程中某一时间段的病理状态。因此，通过祖国医学对人体所处证候的分类研究，用代谢组学方法对生理病理信息进行分析，认识人体的状态特征，从更深层次沟通中西医两种医学体系，是实现中医学证候现代化的有效途径之一。现将代谢组学在中医证候本质研究中的应用概况论述如下。 1 代谢组学 1.1 概况 国际“代谢组学之父” 、英国帝国理工大学 Jeremy

2、 K.Nicholson 教授基于长期对生物体液的研究，于 1999 年提出了代谢组学的概念：定量测量生物系统对病生理刺激和基因修改所做的与时间相关的多参数代谢应答1。从健康到病理改变，从体质到证候，人体的代谢产物会随之发生动态变化。所以，利用代谢组学研究人体代谢物组，可以用于疾病的诊断和中医证候的判断。 1.2 研究方法 代谢组学的研究一般包括代谢组数据的采集、数据预处理、多变量数据分析、标记物识别和途径分析等步骤。生物样品(如尿液、血液和培养液等)采集后进行生物反应灭活、预处理。运用核磁共振、质谱或色谱等检测其中代谢物的种类、含量、状态及其变化，得到代谢谱或代谢指纹，再使用多变量数据分析方

3、法对获得的多维复杂数据进行降维和信息挖掘，并研究相关代谢物变化涉及的代谢途径和变化规律，以阐述生物体对相应刺激的响应机制、发现生物标记物2。 1.2.1 生物样本采集 血浆或血清、尿液、粪便提取物、舌苔液、唾液，以及生物组织样品等各种生物体液，都是代谢组学的生物样本。王全军等3研究 Z24 染毒大鼠血浆的代谢表型改变，及其与组织病理、血液生化指标的相关性，探讨代谢组学在药物毒性早期筛选中的应用。雷荣辉等4运用代谢组学检测纳米铜染毒大鼠的血清代谢成分变化，结合常规血液生化和组织病理学检查，寻找损害早期的代谢标记物，揭示血液代谢表型变化与纳米铜靶器官损害间的关系。王勇等5研究三聚氰胺对儿童尿液代谢

4、的影响，阐明代谢组学能应用于三聚氰胺导致的代谢异常研究，以及三聚氰胺导致肾损伤的无创检测。 1.2.2 测定方法 完成生物样本采集后，需要对代谢产物进行测定。纵观诸多文献，色谱、质谱（MS） 、核磁共振谱（NMR） 、红外光谱、电化学检测等都被广泛应用于代谢组学的研究中。其中，色谱-质谱联用、NMR 成为最主要的测定方法。黄强等6概括了色谱-质谱联用技术在代谢组学中的广泛应用，分别介绍了气相色谱-质谱联用(GC-MS)、液相色谱-质谱联用(LC-MS)、毛细管电泳-质谱联(CE-MS)，以及基于色谱-质谱联用技术的代谢组学数据处理。危阳洋等7基于核磁共振(NMR)代谢组学方法，研究甲亢患者和健

5、康人群的血清和尿液特征代谢物。 1.2.3 多变量数据分析方法 基于代谢组学得到的海量信息，主成分分析（PCA） 、偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)、非线性映射（NLM） 、聚类分析（HCA） 、人工神经元网络(ANN)等模式识别技术成为数据分析的主要应用手段。其中，PCA 和 PLS-DA 是代谢组学研究中常用的分析方法。 2 代谢组学在中医证候本质研究中的应用中医证候是一个复杂的生命现象。近年来孕育而生的代谢组学，能整体反映生物体功能水平，还能精细测量代谢产物。融入当前系统生物学的学术内涵对于中医证候的本质研究将是必然的趋势。后基因组时代的到来，分子生物学作为现代生命科学的前沿学科，

6、为中医证候的本质研究提供了新的研究思路和技术平台。运用代谢组学这一现代最新技术探讨中医证候的本质内涵，为从微观解读中医证候的本质提供了可能，更为中医证候现代研究开辟崭新的研究领域。因此，查阅了近 10 年来的相关文献，总结了以下代谢组学在中医证候本质研究中的应用概况。 2.1 肾阳虚证 董飞侠等8选择慢性肾病期患者 60 例(肾阳虚者、非肾阳虚者各30 例)和体检健康志愿者 30 例，运用尿液代谢组学指纹谱方法进行研究。结果观察到慢性肾病期与正常样本代谢模式差异非常显著，建立的预测能力也很强。25 个差异代谢物排序后，经过标准品鉴定差异性物质的关键代谢成分分别是丙氨酸、胺基丙二酸二乙酯等物质，

7、并且明确变化方向和代谢途径，能很好区分肾阳虚证与非肾阳虚证的差异性。杨丽萍等9采用代谢组学研究发现肾阳虚模型动物的代谢网络明显偏离正常组动物，而用温阳中药干预后，模型动物的代谢谱回归至正常范围，呈现网络修复的结果。 2.2 虚寒证 徐斌等10观察大鼠灌胃给予龙胆水煎剂(RGD)后其尿液代谢谱变化及其与龙胆寒性作用的相关性。测定大鼠尿样的核磁共振氢谱(1HNMR)数据表明，RGD 组与对照组在主成分分析得分图中呈聚类型分布，两组间未见重叠。RGD 组尿样中葡萄糖、氨基酸等明显增加，牛磺酸、氮氧三甲胺等明显减少。长时间给予较大剂量 RGD 可使大鼠出现虚寒证体征，给药后尿液1HNMR 谱变化与龙胆

8、寒性作用相关。 2.3 寒证与热证 汪江山等11采用基于超高效液相色谱-时间飞行质谱(UPLC-Q-TOF)的血浆代谢组学方法，分析类风湿性关节炎(RA)的疾病分型。结果可明显区分 RA 的不同病程(稳定期与活动期)和中医特定证候(寒证与热证)等疾病亚型。因此，代谢组学在阐明传统中医理论，促进中医与现代医学的交流上有着广泛的应用前景。2.4 血热证 刘卫红等12采用核磁共振谱仪技术，分析 53 例银屑病血热证治疗前后及 31 例健康志愿者血浆代谢产物谱的差异。结果显示银屑病血热证患者与健康对照组能被明显区分，银屑病血热证治疗前后也能较好分开。凉血解毒汤能调节银屑病血热证患者的糖脂类代谢，使其代

9、谢网络呈现向正常状态修复的趋势。所以，代谢组学方法能较全面反映生物体的生理病理及代谢状态，并可应用于药效评价研究。 2.5 肝火亢盛证、痰湿雍盛证及阴虚阳亢证 陆益红等13探讨原发性高血压辨证分型与基于 GC/MS 血清代谢组学的关系。应用 GC/MS 测定健康人及原发性高血压病人血清内源性代谢物，分析他们的代谢谱后表明健康人与高血压病人血清代谢谱有明显差异，上述三种证型的高血压可被清晰区分，高血压的发展过程也可显示。可见，基于 GC/MS 和模式识别的代谢组学技术在揭示传统中医理论本质上有着广泛的应用前景，不失为探寻证候物质基础的较适宜手段。 2.6 肝郁脾虚证 等14探讨慢性束缚应激大鼠（

10、肝郁脾虚模型）的血浆代谢表型改变。经过对慢性束缚应激大鼠血浆 1HNMR 谱的分析，表明各组大鼠血浆1HNMR 代谢谱之间存在差异，而且可能从代谢组学分析中找出特异的标志性代谢产物，阐释中医肝郁脾虚证候的生物学本质，探讨代谢组学在中医证候学研究中的应用。因此，代谢组学分析是一种有良好发展前景的中医证候学研究方法。 2.7 痰瘀证 刘卫红等15探讨痰瘀证候的动态演变、时相特点和由痰致瘀在代谢方面的变化。分析高脂血症模型大鼠血浆 1HNMR 谱，显示各组大鼠代谢谱各不相同。随着造模时间的延长，不同时点模型组大鼠的代谢谱亦各不相同，表明高脂血症前期以脂质代谢紊乱为特点，随着病程进展，参与血液凝固过程

11、的乙酰糖蛋白出现，说明凝血机制出现异常，同时酮体及乳酸的升高说明脂质代谢紊乱进一步加重。所以，可能从代谢组学分析中找出痰瘀演变过程特异的标志性代谢产物，以阐释中医痰瘀证候的生物学本质。 2.8 痰阻心脉证、气阴两虚证 王广基等16基于 GC-TOF/MS 代谢组学方法，对痰阻心脉和气阴两虚型冠心病患者血浆中小分子化合物进行全面检测，以探索血浆内源性化合物的差异。结果表明代谢组学方法可区别这两证型冠心病，还可以与健康组明显区分。而且，这两证型间多个内源性代谢物的含量存在明显差异，并与能量、氨基酸和核苷酸代谢异常相关。可见，代谢组学的整体数据和标志物信息均显示出痰阻心脉和气阴两虚型冠心病的差异，提

12、示代谢组学所研究的体内小分子化合物可能正是中医分型的物质基础。2.9 气虚血瘀证 李林等17利用核磁共振氢谱方法研究气虚血瘀证大鼠对比于正常大鼠尿液的组成变化，发现病变大鼠尿液中甲酸、肌氨酸酐、-酮戊二酸、柠檬酸等成分含量发生了变化，为进一步提示气虚血瘀证的产生机制和病症治疗提供了证据。此外，用 GC-MS 方法研究慢性心肌缺血属于气虚血瘀证的小型猪血浆样本发现18，脂质代谢物如甘油、醋酸等，肌醇，氨基酸和脯氨酸的代谢水平明显提高，而葡萄糖、氨基酸和脂质代谢物的含量大幅下降。可见，这个代谢模式可用于临床诊断和治疗慢性心肌缺血，也可为中医气虚血瘀证的研究提供新思路。 2.10 湿证 本课题组中医

13、湿证的代谢研究，如：慢性肾衰中医湿证的尿液代谢组学研究、慢性胃炎中医湿证的舌苔液代谢组学研究等都是采用了色谱-质谱联用方法进行了研究，并得出了相应的代谢产物。 基于以上各种代谢组学方法对于中医证候的本质研究，总结其优缺点如下。核磁共振谱（NMR）和色谱-质谱联用是中医证候本质研究的两种常用方法。核磁共振谱方法，很适合研究代谢产物中的复杂成分，核磁共振氢谱(1HNMR 谱)最为常用。NMR 法极具实用性，对生物样品的预处理快速又简便；可检测整体动物或人体特定器官细胞内的代谢物组而无损伤性。但其缺点是灵敏度较低。色谱-质谱联用，如 GC-MS、超高效液相色谱-时间飞行质谱(UPLC-Q-TOF)、

14、GC-TOF/MS 等都被应用于中医证候的本质研究。对生物样本内复杂代谢物中的多种成分进行定性和定量分析，无偏性、高效快速、灵敏度高。不过，每种色谱-质谱联用技术都有其不足之处。GC-MS 预处理过程较繁琐，衍生化方法复杂，GC 分离效率不高；LC-MS 缺少谱图数据库，难以鉴定化合物的结构；GC-TOF/MS 的数据处理甚为复杂，不易灵活运用。 3 目前存在的问题 代谢组学在中医证候本质研究中的应用广泛，并取得了一定的研究成果。目前，基于代谢组学技术在中医证候本质研究方面依然存在一些不足之处。中医证候本质的代谢组学研究平台尚不完备。由于代谢组学研究的仪器设备成本较大，研究单位难以有足够的资金

15、加以引进来研究。中医证候的临床研究病例数偏少，代谢组学结果难以与临床病证相衔接，不能很好进行数据分析。代谢组学研究中医证候本质的背景资料积累很少，难以建立数学模型。要进行有意义的中医证候代谢组学研究，必须有大量正常生理状态的研究基础作为背景资料，从而运用生物信息学技术解决数学建模。代谢组学研究的影响因素很多，各项中医证候临床质量控制标准(如饮食、年龄等)不均衡，不能保证研究结果的可重复性。各种组学数据的不对接，得出的结果会有片面性，不能全面说明中医证候的本质。 4 未来展望和思考 运用代谢组学研究中医证候的本质，有着无限发展的空间。完善代谢组学的研究平台；临床研究中要进一步扩大样本量，以加大说

16、服力；注重代谢组学背景资料的积累，为数学建模做铺垫；尽量控制中医临床数据采集的影响因素；综合分析基因组学、转录组学、蛋白组学、代谢组学等系统生物学的共同数据，加强多学科交叉融合，降低研究成本强调中医基础理论的支撑作用，完善代谢组学的研究技术，避免理论研究与临床实践脱节，提高中医证候研究的可操作性和数据分析的针对性。 采用代谢组学相关技术与方法进行中医证候研究，有望在中医药领域取得突破性进展。结合中医基础理论和临床实践，充分借助现代技术，采用现代语言阐释中医独特的思维方式和治疗方法，这是实现中医证候本质研究的必由之路。相信随着人力和物力的不断投入，以及应用范围的不断扩大，基于代谢组学的中医证候本

17、质研究必将在未来实现质的飞跃。 代谢组学实质上是采用系统生物学思路进行研究代谢小分子组的一种高通量分析方法，通过比较不同条件下的小分子代谢谱的异同，在医学上用于诊断、毒理和药理研究，并且通过对小分子代谢谱的全面定性、定量分析19，可有效找到生物标志物或生物标志模式。运用代谢组学进行中医证候的本质研究，为中医证候客观化研究提供了新的思路和线索，更为中医药的现代化和国际化开辟新的方向。随着当代生物科学技术的飞速发展，中医证候本质的现代化研究正面临借鉴新观念和新技术，寻找合适的切入点，来促进自身发展的机遇。代谢组学将为中医药现代化研究提供一种非常有用的技术手段。 总之，代谢组学是一门前沿性科学，研究

18、方法多种多样。中医证候的本质研究，有无限的挖掘空间。基于代谢组学来研究中医的诸多证候本质，已初步显现出了明显的优势。虽然目前还存在一些地方需要改进，但随着现代科学技术的不断进步，代谢组学势必将对中医药的现代化研究起到推波助澜的作用，对推进未来中医药现代化的进程具有重要的现实意义。 参考文献 1 Nicholson JK, Lindon JC, Holmes E.Metabonomics:understanding the metabolic responses of living systems to pathophysiological stimuli via multivariate statistical analysis of biological NMR spectroscopic dataJ.Xenobiotica，1999,29(11):1181-1189