抗CD3单链抗体基因克隆表达及生物活性鉴定.doc

1、抗 CD3 单链抗体基因克隆表达及生物活性鉴定【关键词】 单链抗体 【关键词】 CD3 分子； 单链抗体 【Abstract】 The genes encoding antibody heavy and light chain variable regions (VH and VL) were cloned by RTPCR from OKT3 hybridoma cells, which produced antiCD3 moleclonal antibody. The VH and VL genes were fused and become a single chain Fv (scFv

2、). The scFv gene was cloned into pCANTAB5E vector and expressed on bacterial phage surface. By three panning rounds, we have obtained two singlechain antibodys that specific for CD3. The antiCD3 scFv will be a reagent for diagnosis and therapy of immunodisorder 1 实验资料 杂交瘤细胞 OKT3来自 ATCC.质粒 pCANTAB5E，

3、大肠杆菌 TG1和HB2151，内切酶 SfiI和 NotI, 可变区引物均购自 Pharmacia公司.Taq DNA聚合酶，mRNA 磁性分离试剂盒购自 Promega公司.以分泌抗 CD3单克隆抗体的鼠杂交瘤细胞 OKT3为原始材料，采用 Promega公司试剂盒，从大约 107细胞中分离和纯化 mRNA，合成 cDNA第一链.通过 RTPCR分别扩增出重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因. 为了加强抗体轻、重链可变区（Fv）的稳定性和更好地维持抗体分子内结合抗原区的空间构象，在 VH和 VL基因之间用一段编码(Gly4Ser)3 的 DNA序列把二者连接起来, 构成抗体可变区单链

4、融合基因.为了把单链抗体基因插入pCANTAB5E 质粒，我们以单链抗体基因为模板，引入一对含 SfiI和 NotI 酶切位点的引物， 再次 PCR 扩增.扩增产物 Mr约 720，基因大小与预测的单链抗体基因相符合（图 1）.把单链抗体基因插入到表达载体pCANTAB5E所含的噬菌体外壳蛋白 g3p基因中. 转化大肠杆菌 TG1感受态细胞后，在辅助噬菌体 M13K07的作用下，单链抗体和外壳蛋白 g3p以融合蛋白的形式表达于噬菌体的表面，形成一个抗 CD3单链抗体文库.以外周血单核细胞为抗原，用 ELISA方法鉴定噬菌体抗体的免疫活性.首先用细胞分离液分离外周血 T细胞，然后包被在经多聚赖氨

5、酸处理过的 96孔酶联板上.分别与重组噬菌体抗体温育 1 h,用 PBS淋洗 3次后，加入 HRP标记的抗 M13噬菌体抗体温育 1 h, 再用 PBS淋洗 3次，加入底物进行颜色反应.用酶标仪在 490nm处检测每孔的吸收值.挑选阳性克隆，感染大肠杆菌，获得培养上清，再进行免疫活性鉴定.经过三轮亲合感染扩增的免疫筛选过程，使 CD3重组噬菌体抗体得到富极. 随机挑选 12个重组噬菌体抗体克隆进行 ELISA检测.从中选出免疫活性最强的两株阳性克隆.把这两株阳性克隆的基因转入大肠杆菌 HB2151，经 IPTG 诱导培养后，可在上清中收集可容性单链抗体.ELISA 进一步证明该抗体能够特异识别

6、外周血单核细胞和淋巴母细胞性白血病细胞，而不结合黑色素瘤细胞和人宫颈癌细胞(图 2).说明单链抗体保留了原单克隆抗体的抗原特异性. 1:1 kb标准分子量；2:抗体 VL基因 PCR扩增产物；3：重组质粒经XbaI和 BamHI双酶切，鉴定 VL基因；4：抗体 VH基因 PCR扩增产物；5：重组质粒经 Xho和 Hind双酶切，鉴定 VH基因. 图 1 琼脂糖凝胶分析 PCR产物和重组载体酶切产物鉴定（略） 可溶性单链抗体结合外周血单核细胞（PBC）和淋巴母细胞性白血病细胞（MOLT4） ，但不结合黑色素瘤细胞（A375）和人宫颈癌细胞（Hela）. 图 2 ELISA检测单链抗体免疫活性（略

7、） 2 讨论 单链抗体被认为是具有抗原结合能力的最小功能单位1.它在某些应用方面比完整抗体具有更多的优越性，如免疫原性较小，组织渗透性好, 在组织和血液中的清除率快，容易与其他功能分子重组，形成多功能抗体2-4.另外，单链抗体能够在原核系统中高效表达，有利于大批量生产.CD3 分子是 T淋巴细胞膜上特有的重要信号分子之一 5，6.抗 CD3单链抗体与其他功能分子结合所形成的双功能抗体在免疫调节和肿瘤治疗方面以显示出良好的应用前景7，8.我们构建了抗CD3单链抗体基因，利用噬菌体展示技术表达单链抗体，通过免疫筛选，获得 CD3特异基因工程抗体.该抗体为双功能抗体和重组免疫毒素的研制打下了基础.

8、【参考文献】 Kuroki M, Arakawa F, Khare PD, Kuroki M, Liao S, Matsumoto H, Abe H, Imakiire T.Specific targeting strategies of cancer gene therapy using a singlechain variable fragment (scFv) with a high affinity for CEAJ. Anticancer Res, 2000;20(6A):4067-4071. 2 Takemura S, Asano R, Tsumoto K, Ebara S, Sa

9、kurai N, Katayose Y, Kodama H, Yoshida H, Suzuki M, Imai K, Matsuno S, Kudo T, Kumagai I. Construction of a diabody (small recombinant bispecific antibody) using a refolding systemJ. Protein Eng, 2000 ;13(8):583-588. 3 Weetall M, Digan ME, Hugo R, Mathew S, Hopf C, TartRisher N, Zhang J, Shi V, Fu F

10、, HammondMcKibben D, West S, Brack R, Brinkmann V, Bergman R, Neville D Jr, Lake P.Tcell depletion and graft survival induced by antihuman CD3 immunotoxins in human CD3 epsilon transgenic miceJ.Transplantation, 2002;73(10):1658-1666. 4 Hexham JM, Dudas D, Hugo R, Thompson J, King V, Dowling C, Nevil

11、le DM Jr, Digan ME, Lake P. Influence of relative binding affinity on efficacy in a panel of antiCD3 scFv immunotoxinsJ.Mol Immunol, 2001;38(5):397-408. 5 Hombach A, Wieczarkowiecz A, Marquardt T, Heuser C, Usai L, Pohl C, Seliger B, Abken H. Tumorspecific T cell activation by recombinant immunorece

12、ptors: CD3 zeta signaling and CD28 costimulation are simultaneously required for efficient IL2 secretion and can be integrated into one combined CD28/CD3 zeta signaling receptor moleculeJ.J Immunol, 2001;167(11):6123-6131. 6 张文霁,韩泉洪，惠延年，马吉献. 增生性玻璃体视网膜病变组织中的 T淋巴细胞与 HLADR抗原J.第四军医大学学报,2001；22(10)：916-918. 7 Wuest T, Moosmayer D, Pfizenmaier K.Construction of a bispecific single chain antibody for recruitment of cytotoxic T cells to the tumour stroma associated antigen fibroblast activation proteinJ.J Biotechnol, 2001;92(2):159-168. 8 栗 艳， 阎 露. 吸烟对 T，B 淋巴细胞的影响J. 第四军医大学学报,2001；22(13)：1191-1193.