米非司酮对人宫颈癌HeLa细胞生长及其NF-κB p65表达的影响.doc

1、米非司酮对人宫颈癌 HeLa 细胞生长及其NF-B p65 表达的影响【摘要】 目的 探讨米非司酮(mifepristone,MIF)对人子宫颈癌 HeLa细胞增殖及其 NF-B p65 蛋白表达水平的影响。方法 体外培养人子宫颈癌 HeLa 细胞，采用 MTT 法观察不同浓度 MIF(5、10、20 mol/L)对HeLa 细胞增殖的抑制作用；采用 Western blot 法检测 MIF 对 HeLa 细胞中 NF-B p65 蛋白表达水平的影响。结果 3 个浓度的 MIF 均能显著抑制HeLa 细胞的增殖，呈剂量依赖性；MIF 可以使 HeLa 细胞中 NF-B p65蛋白表达水平下降。

2、结论 MIF 对宫颈癌 HeLa 细胞体外生长具有明显的抑制作用，并且下调 HeLa 细胞 NF-B p65 蛋白的表达。 【关键词】 宫颈肿瘤;人宫颈癌 HeLa 细胞株；米非司酮；核因子-B p65 Abstract: Objective To investigate the effect of mifepristone on cell proliferation and the expression of NF-B p65 of human cervical carcinoma cell line HeLa. Methods Human cervical cancinoma cell l

3、ine HeLa was cultured in vitro. The antiproliferation effects of three different concentrations of mifepristone (5, 10 and 20 mol/L) on HeLa cell line were detected with MTT assay. Western blot method was performed to examine the effect of mifepristone on the expression of NF-B p65 protein of HeLa c

4、ell line. Results Three different concentrations of mifepriston inhibited the proliferation of HeLa cells in a dose-depending manner. The inhibition by mifepristone reached a plateau at 20 mol/L. The expression of NF-B p65 was reduced by mifepristone in HeLa cells. Conclusion Mifepristone has a sign

5、ificant inhibition effect on the growth of cervical carcinoma cell line HeLa in vitro and can down-regulate the expression of NF-B p65 protein of HeLa cell line. Key words: cervix neoplasms; human cervical carcinoma cell line HeLa; mifepristone; NF-B p65 米非司酮(mifepristone,MIF)是 20 世纪 80 年代由法国 Rousse

6、l Uclaf 药厂人工合成的抗孕激素药物，目前在临床上主要用于终止早孕、引产等。但近年研究发现，MIF 还具有抗肿瘤、增强抗癌药物疗效等其他临床新用途；核因子-B (nuclear factor B,NF-B)是一种具有多向调节功能的核转录因子，它参与细胞的增殖、凋亡和癌基因的转录调控，并被证实和宫颈癌的发生发展密切相关1-2 ，NF-B p65 则是NF-B 在体内发挥生理功能的主要亚单位之一。目前，关于 MIF 对人宫颈癌 HeLa 细胞生长影响及其与 NF-B p65 蛋白表达的关系尚少见报道，为此我们设计了此实验，研究不同浓度的 MIF 对人宫颈癌 HeLa 细胞生长及其 NF-B

7、p65 蛋白表达的影响，探讨 MIF 对宫颈癌的治疗作用及其可能的作用机制，为宫颈癌的防治寻找新途径。 1 材料和方法 1.1 材料 人宫颈癌 HeLa 细胞株（中国医学科学院血液病研究所，天津） ；MIF 纯粉剂（浙江仙琚制药股份有限公司） ；DMEM 干粉（美国Gibco 公司） ；MTT（美国 Amersco 公司） ；NF-B p65 抗体（碧云天生物技术研究所） 。 1.2 方法 1.2.1 细胞培养 常规复苏冻存的宫颈癌 HeLa 细胞，接种于盛有DMEM 培养液（含 10%胎牛血清、105 U/L 青霉素、105 U/L 链霉素）的培养瓶中，细胞于培养液中在 37、体积分数 5%

8、 CO2、饱和湿度培养箱内培养，隔日更换新培养液 1 次。平均 34 天传代 1 次。 1.2.2 实验分组 将培养的 HeLa 细胞随机分为用药组和对照组。用药组：分为 3 个剂量组（n=6） ，分别含有浓度为 5、10、20 mol/L的 MIF，各组 DMEM 培养液中乙醇终浓度小于 0.2%，含有 7%胎牛血清。对照组（n=6）：培养液中不含 MIF，只含与用药组相同浓度的乙醇和胎牛血清。 1.2.3 MTT 法检测 MIF 对 HeLa 细胞增殖的影响 收集对数生长期细胞，制备成单细胞悬液，以每孔 8000 个细胞接种到 96 孔培养板中，24 h 后观察细胞已贴壁，分组施加药物干预

9、。分组情况如上所述，每组设 6个平行孔，继续培养 72 h，每孔加入 5 g/L 的 MTT 溶液 20 l，孵育 4 h，弃上清液，每孔加入 150 l 二甲亚砜，低速振荡 30 min，用酶标仪在 492 nm 处测定光密度(D 值)。按下列公式计算抑制率： 抑制率=(1-用药组 D 值/对照组 D 值) 100%。 1.2.4 Western blot 法检测 NF-B p65 的表达 取对数生长期的HeLa 细胞，制成单细胞悬液，以每孔 8105 个细胞接种于 6 孔培养板中，24 h 后观察细胞已贴壁，分组施加药物干预。分组情况如上所述，每组重复 3 个孔，继续培养 72 h，收集细

10、胞，按一种新改进的核蛋白的抽提方法3提取核蛋白。将核蛋白提取液进行蛋白浓度测定后，依次行SDS-PAGE 电泳、半干转膜、抗原-抗体反应、显色，拍照。实验过程中，以 -actin 作为内参进行检测，保证实验结果的准确性。最后用 Image J 图像分析软件对条带进行分析，测定其灰度值。NF-B p65 条带灰度值与 -actin 条带灰度值的比值即为 NF-B p65 蛋白相对含量。 1.3 统计学处理 应用 SigmaStat 2.03 统计学软件对结果进行统计分析，各组数据以s 表示，采用单因素方差分析(one-way ANVOA)，P0.05 为差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 M

11、IF 对 HeLa 细胞生长的影响 MTT 法结果显示，与对照组相比，3 种浓度的 MIF 作用 72 h 后均抑制了宫颈癌 HeLa 细胞的增殖，抑制率随MIF 剂量的增加而增加，作用呈剂量依赖性；用药各剂量组与对照组相比以及用药各剂量组之间两两比较，差异均具有统计学意义(P0.01)。见表 1。表 1 MIF 对 HeLa 细胞增殖的影响 用药各剂量组与对照组比较及用药组间两两比较：P0.01 2.2 MIF 对 HeLa 细胞 NF-B p65 表达的影响 Western blot 结果显示，各组细胞中 -actin 蛋白的表达量基本相同，表明各组样品蛋白上样量基本一致；用药组 NF-B

12、 p65 蛋白相对表达量均明显低于对照组(P0.01)；随着药物浓度的增加，MIF 对 NF-B p65 蛋白表达下调作用明显增强，且用药各剂量组之间的差异均具有统计学意义(P0.01)。见图 1、表 2。 3 讨 论 3.1 MIF 对 HeLa 细胞体外生长抑制作用 MIF 是目前惟一用于临床的孕激素受体拮抗剂，临床上主要用于终止早中期妊娠等。近年来，随着研究的不断深入，发现 MIF 还具有抗肿瘤、增强抗癌药物疗效等新用途。目前，已有用 MIF 治疗子宫肌瘤4 、子宫内膜癌5和卵巢癌6的报道，而且研究发现，MIF 对孕激素受体（progesterone receptor,PR）阳性和 PR

13、 阴性的卵巢癌细胞系均具有明显的生长抑制作用6 。这意味着 PR 并不是 MIF 抗肿瘤细胞增殖的必需要素，MIF 除作为 PR 拮抗剂发挥抗肿瘤作用外，还可以通过其他途径抑制肿瘤的生长。 分子生物学研究显示，宫颈癌的发生、发展与人乳头状病毒（human papilloma virus,HPV） ，特别是高危型 HPV 感染密切相关7 。近年研究发现，类固醇激素如雌激素、孕激素能上调 HPV 基因的表达，促进宫颈癌的发生发展，而 MIF 能通过阻断类固醇激素的作用，抑制 HPV基因的表达，从而抑制 HPV 阳性的宫颈癌细胞的生长8-9 。 本实验发现不同浓度的 MIF(5、10、20 mol/

14、L)作用于宫颈癌 HeLa细胞 72 h 后，均能抑制细胞的生长，抑制率分别为22.95%、33.49%、46.61%，呈剂量依赖性,说明 MIF 对宫颈癌 HeLa 细胞体外生长具有明显的增殖抑制作用。 3.2 MIF 对子宫颈癌 HeLa 细胞 NF-B p65 表达的影响 临床和基础研究显示，诱导肿瘤细胞凋亡是抑制肿瘤生长、提高肿瘤细胞对化疗和放疗敏感性的关键所在。近年来一些学者发现 NF-B 在调节细胞凋亡中起着重要作用，并与肿瘤的发生、浸润和转移关系密切。正常情况下，NF-B 在胞质内与抑制性蛋白（IB、IB、Bcl-3 等）结合，以无活性状态存在于胞质中；但当有刺激因子如肿瘤坏死因

15、子(TNF)、白细胞介素(IL)、生长因子、放射线、一些细胞毒性药物、病毒和细菌等作用时，可激活 NF-B 系统，活化的 NF-B 则转位进入细胞核，调控相关基因的转录和表达，且具有多向转录调节功能。NF-B p65 是 NF-B在体内发挥生理功能的亚单位之一10 。因此，抑制 NF-B 活化，下调 NF-B p65 表达，可抑制肿瘤的生长并提高肿瘤细胞对抗肿瘤药物和放射线介导的凋亡的敏感性。研究发现，MIF 对 NF-B 的调节作用以及NF-B 对细胞凋亡的调节作用具有细胞特异性，并与不同的刺激因素有关11 。 研究发现，NF-B 在宫颈癌组织中高表达并与宫颈癌的发生和发展密切相关11 。本

16、研究采用 Western blot 方法分析不同浓度的 MIF 对人子宫颈癌 HeLa 细胞核蛋白中 NF-B p65 蛋白表达的影响，结果显示，与对照组相比，3 种浓度的 MIF 均能下调 NF-B p65 蛋白的表达，其作用呈剂量依赖性。 综上所述，我们认为，MIF 具有抑制人宫颈癌细胞生长、抑制 NF-B 活化和下调 NF-B p65 蛋白表达的功能；抑制 NF-B 活化与下调NF-B p65 蛋白表达可能是 MIF 抑制 HeLa 细胞生长的机制之一。MIF 口服耐受性良好，不良反应小，有望成为临床上治疗宫颈癌的有效药物或提高放疗、化疗敏感性的辅助用药，但是其确切的抗肿瘤作用机制，尚需

17、进一步研究探讨。而且，MIF 对宫颈癌的确切疗效和适用性尚需通过体内实验（包括动物实验和临床实验）进一步研究。 【参考文献】 1 程大丽,张淑兰.核转录因子与细胞周期蛋白 D1 在宫颈癌中的表达及相关研究J.中国现代医学杂志,2005,15(13):1935-1944. 2 林巧爱,陈向敏,夏克栋，等.NF-B、COX-2 在宫颈癌组织中的表达及其与 HPV16 感染的关系J.癌变畸变突变，2007,19(2):113-115. 3 王 勇,黄文华.一种改进的核转录因子的电泳迁移率改变分析法J.第三军医大学学报,2001,23(1):119-120. 4 Fiscella K, Eisinge

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