锚原纤维与营养不良性大疱性表皮松解症.doc

1、锚原纤维与营养不良性大疱性表皮松解症关键字： 表皮松解症 锚原纤维具有维持真表皮紧密连接的作用，其主要结构成分是型胶原基因（COL7A1）突变是营养不良性大疱性表皮松解症（DEB）的分子发病机制。本文主要综述如下两上方面的研究进展：型胶原的分子结构、基因结构及其调控功能；COL7A1 的提早终止密码突变突变（PTC）和甘氨酸置换突变对锚原纤维分子生物学特性的影响型胶原的数量变化和质量变化（分子折叠、聚合和分泌等发生异常）是 DEB发病的分子基础。锚原纤维（anchoring fibrils）从表皮基底膜带的致密板向下方的真皮结缔组织延伸并终止于锚板、或者再折返致密板。在真皮中锚原纤维常与真皮的

2、带状胶原纤维相互镶嵌交织，从而确保真表皮间的紧密连接。锚原纤维的主要结构成分是型胶原，型胶原在维持真皮连接结构稳定性中具有非常重要的作用。它的缺失或形态异常会导致真表皮连接结构的不稳定。使皮肤在机械创伤导致真表皮连接结构的不稳定，使皮肤在机械创伤或表皮磨擦时，即可发生表皮与真皮的分离，从而形成一种遗传性皮肤病营养不良大疱性表皮松解症（dystrophic epidermolysis bullosaDEB） 。DEB 的分子发病机制是由型胶原基因（typecollagen gene，COL7A1）突变所致。自 1993 年首次识别 COL7A1 突变以来，在不同临床类型的 DEB 中，在 COL

3、7A1 上迄今识别的突变有 200 个以上。但是如此众多的突变及其所致生物学后果（如基因型与表型关系）极其复杂，这方面的研究才刚刚开始。 1、型胶原的分子结构 型胶原是由三个相同的 1（）链构成的同源三聚体，第一1（）多肽链含有中央胶原性三螺旋区（145kDa） ，两侧为非胶原性近基端 NC-1（145kDa）和羧基端 NC-2（30kDa） 。胶原性结构区由特征性 Gly-X-Y 重复序列构成三螺旋结构域，其间被非胶原性短片段打断 19 次。其中 1 次是由 39 个氨基酸组成的较大片段（被称为“铰链”区）插入胶原性结构区中央。139 个氨基酸组成大小不等的短片段使型胶原分子具有结构柔韧性、

4、构象可塑性。这种独特结构使由型胶原构成的锚原纤维具有维持具表皮紧密连接的作用。这些非胶原性短片似乎是三螺旋区 Gly-X-Y 重复序列连续性的“间断” ，但是由于这种结构对螺旋结构的稳定性具有决定意义，因此在进行上要特殊保存。 型胶原三螺旋区和 NC-2 连接区富含半胱氨酸。这些半胱氨酸形成的二硫键是 1（）分子多聚体形成过程所必需的。在体内，前 1 分子 NC-2 区发生部分裂解后，两个分子借二硫键作用而形成反向平行的二联体，三个同源 1（）再侧向聚合成型胶原三聚体、最后缔合成型胶原多聚体（即锚原纤维）并插入致密板中，致密板中的层粘连蛋白5（3 和/或 2 链）可结合型胶原 NC-1 区。

5、2、型胶原合成的调控 型胶原主要由角质形成细胞合成，主要表达于复层鳞状上皮如皮肤、粘膜和角膜。型胶原分子生物学特性明显受生长因子和细胞因子的控制，受邻近细胞和胞外基质旁分泌的影响。真表皮连接不足之处真皮中的蛋白多糖具有结合调控信号分子、接带和真皮中的蛋白多糖具有结合调控信号分子、吸附多种细胞因子的功能，在发育、修复或损伤等生理或病理过程中的功能，在发育、修复或损伤等生理或病理过程中这些信号分子和细胞因子可诱导 COL7A1 的表达，刺激型胶原的合成和分泌。皮肤微丝蛋白贮存 TGF 异构物（isoform） ，并输送至紧靠基底层的角质形成细胞、刺激角质形成细胞的型胶原表达。最近 Vindevog

6、hel等研究发现 COL7A1 启动子有两个独特区段 496/490 和 453/444，是 TGF- 异构物结合 DNA、发挥调控功能时必需首先识别的特异性序列。此外，IL-11、IL-1、TNF- 等炎性细胞因子可调控角质形成细胞内型胶原 mRNA 的表达。 3、COL7A1 的基因结构 遗传性 DEB 的致病基因型胶原基因（COL7A1）定位于 3p21.1上，全长约为 23kb，由 118 个编码外显子组成（Genbank no：L23 982） ，这多于已报道的任何一个基因的外显子数量。COL7A1 转录产物为9.2kb，其中有 8.8kb 编码前 胶原的 2944 个氨基酸，其分子

7、量为320kDa。从转录起始点到多聚腺苷化位点由 31132bp 组成，它的长度仅仅是型胶原 mRNA 的 3 倍左右，因此 COL7A1 是一个内含子序列小、外显子排列紧凑的基因。 4、型胶原基因突变的致病机制 DEB 特征性表现皮肤或粘膜脆性增加是由于锚原纤维缺少、甚至完全缺如、或结构异常，从而使表皮与真皮分离、形成大疱。在透射电镜下，正常皮肤锚原纤维为极纤细、呈中心对称、彼此呈带状交叉；但是，DEB皮损显示粗大、稀疏、扁平而无彼此交叉的纤维。 DEB 有六种临床亚型，两种显性遗传性和四种隐性遗传。已证实COL7A1 突变是显性和隐性 DEB 的发病基础，尽管也在几个种族中报道了数个复发性

8、突变，如墨西哥人常见突变为 24700insG，英国人常见突变为R578X 和 778delG，但大多数突变具有极大的家系特异性和种族特异性。表型异质性的表达可能是由于型胶原突变分子引起“蛋白质自杀” ，或者是两个等位基因上不同突变组成的复合杂合子的后果不同，或者是某些突变表型可能需要两个等位基因纯合子的共表达。 COL7A1 突变检测资料表明基因型与表型之间具有密切关系。型胶原的两个等位基因完全缺失可导致锚原纤维和型胶原完全缺如，是隐性 DEB 的一种最严重型的特征性病变。隐性遗传性 DEB 的大多数突变是复合杂合子突变，是无义突变或移码突变和由小插入或缺失引起提早终止密码突变（premat

9、ure termination codon mutation，PTC） ，而不是纯合子突变。无义突变可促使 mRNA 分解，从而使 mRNA 转录物减少。无义突变与 PTC 相关，当为杂合子时 PTC 突变呈沉默型，但是当为纯合子或 PTC 与另一等位基因的 PTC 相组合时患者表型明显加重。例如一例泛发性隐性 DEB 患者为复合杂合子突变 3857delA/G182R，在无血缘关系的双亲中发现父亲为 PTC 突变（3857delA） ，但没有相应临床表现，当与母亲的甘氨酸沉默置换相组合时，复合杂合子先证者却表现泛发性大疱、甲缺失，甚至轻度并趾的严重表型。对 PTC 杂合子携带者，患者仅表达正

10、常等位基因产物，而不表达截短多肽。另外，某些由隐性突变和显性突变相结合的家系可发生显著的表型改变、加重。 几乎所有的显性 DEB 是由甘氨酸置换突变所致。甘氨酸置换突变，或甘氨酸置换突变/无义突变相组合主要引起表型较轻的显性 DEB。表型较轻的显性 DEB 可合成突变的型胶原多肽，但是形态异常的锚原纤维。Rouan 等在分析 6 例 DEB 家系时发现他们全都存在甘氨酸置换突变，其中3 例家系的双亲发生甘氨酸置换 G204R 和 G2040V，却没有临床表现。甘氨酸是最小氨基酸分子，当发生甘氨酸置换时，大分子氨基酸可能干扰型胶原三螺旋功能域的形成、妨碍前-1()多肽的折叠、聚合、分泌等。因为型

11、胶原是同源三聚体，显性 DEB 患者可能仅有 1/8 的胶原分子是由三个正常前-1()多肽构成。因此，在型胶原的形成过程中，突变的多肽可通过显性负干扰（dominantnegative interference）导致表型较轻的显性遗传疾病发生。 突变资料的分析表明是一部分而不是所有型胶原上的甘氨酸置换，都以显性负干扰方式影响蛋白质的生物合成。外显子 73 的三个点突变引起型胶原三螺旋结构区甘氨酸置换（G20006D、G2034E 和 G2015E） ，从而干扰胶原的折叠、聚合和分泌。与此相对照，三螺旋区另一区段发生的甘氨酸置换 G1519D，既没有前胶原的分泌障碍也没有锚原纤维的功能异常，因此

12、不表现甘氨酸置换的相应表型。所以，型胶原是胶原中的一个突出特例，因为不是所有三螺旋区内的甘氨酸置换都产生显性负干扰。 从表型和遗传方式来看，仔细观察 COL7A1 整个三螺旋区的甘氨酸置换突变，发现型胶原多肽上甘氨酸置换的位置应特点表明突变的后果具有位点独立性。这可能是由于胶原性三螺旋区需要许多具有协同作用的三螺旋基本结构单无构成一个统一整体，一些结构单元对整个蛋白质功能的影响比另一些结构单元更重要。因此，型胶原多肽链某一具体位置的甘氨酸置换对分子整体稳定性的影响可能取决于它在特定三螺旋亚功能区内的构象位置，而不是它在整个胶原性结构区的物理位置。 5、从 DEB 看型胶原的生物学特性 通过对

13、DEB 分子发病机制的临床和实验研究，大大增长了人们对锚原纤维生物学特性、COL7A1 突变及其后果的新知识、新见解。 在型胶原基因上，无义突变杂合子携带者没有临床表型、没有相应的病理改变，这说明蛋白质数量减少 50%仍不足以妨碍真表皮的粘附作用。这种现象在网蛋白、整合素 64、型胶原、层粘连蛋白 5等的基因上也存在。从而充分表明了锚原纤维复合体的蛋白成分功能重要性。无义突变可导致 mRNA 衰减和多肽合成不足。因此，PTC 杂合子携带者不仅不表达正常等位基因产物，而且也不表达截短的异常多肽。体外实验表明 COL7A1 无义突变杂合子携带者的角质形成细胞合成的型胶原数量减少，这说明 DEB 患

14、者正常基因产物的表达不可能人偿性上调。仅存在正常皮肤型胶原的一半就足以维持真表皮的粘连作用。与此相一致，Tidman 等曾根据超微结构形成分析推测 DEB 患者皮肤中锚原纤维的数量是正常人的 0%30%。 锚原纤维不难能“耐受”型胶原数量的减少，而且在很大程度上也能“耐受”质量的异常。甘氨酸置换特别有意义，因为型胶原的许多甘氨酸置换在生物学上和临床上仍保持沉默。对所有胶原来说，三螺旋区内小分子甘氨酸被其他分子较大的氨基酸取代后，突变的 链可与正常的多肽链一起聚合、折叠为胶原多聚体三螺旋区，进而使一些结构上异常的三聚体分子也合并入纤维结构中，产生显性负干扰现象。因此，超微巨分子的组装特别强调基本

15、结构单元的极小结构异常所产生的最终致病性后果，从而使这种纤维产生功能缺陷。但是，型胶原是这个规律的一个突出特例，型胶原这一特性表现在引起甘氨酸置换的 COL7A1突变携带者根本没有临床表型。根据 DEB 突变的检测资料目前尚不能确定型胶原三螺旋区不同位置的甘氨酸置换与其病理表现严重程度二者间是否存在一定的相互关系。甘氨酸置换只报道了一小部分，所有病例可能没有记载极微小的表型变化。例如，一个 DEB 家系先前的报道疏忽母系成员的大趾甲营养不良这一轻微的表现，后经临床仔细检查和突变筛查发现该家系为一显性革氨酸置换突变 G2287R。许多突变可反式作用于另一等位基因上的突变并产生效应，这使和正确评价

16、基因型与表型的相互关系更加复杂。很明显，准确评价不同突变型胶原分子的生物化学稳定性及其他特性将有助于阐明 COL7A1 基因缺陷的分子后果。甘氨酸置换具有紧靠非胶原性“铰链”区下游的族集性特点。据资料分析，26种三螺旋区的甘氨酸置换中，有一半发生在 G1982W 至 G2079E 范围内紧靠非胶原性“铰链”区下游。两个体外实验研究提示紧靠型胶原铰链区的甘氨酸置换（G2006D，G2034R 和 G2015E）以显性负干扰蛋白分子折叠、导致细胞内突变分子的堆积，但是，靠近三螺旋区末端的一个连续性 Gly-X-Y 长序列内的甘氨酸置换（G134R 和 G1519D）却在生物学上和临床上保持沉默。这

17、睦观察结果表明与三螺旋区内的铰链或“间断”序列有关的不同位置上的甘氨酸置换对异常分子最终后果的大小具有决定意义。 在两个 DEB 家系中发现型胶原较大的缺失明显产生轻度的显性负干扰。一个家系中，杂合性外显子内的缺失改变基因剪接位点、消除型胶原三螺旋区中心的 10 个 Gly-X-Y 三螺旋；在另一家系中导致三螺旋区羧基侧一半区 8 个 Gly-X-Y 三螺旋消失。在体外实验中先证者的角质形成细胞合成的型胶原多肽是截短的多肽，尽管与正常细胞相比在数量上相等。这表明前胶原在细胞内有滞留，但是也有一部分突变分子被分泌，这些细胞外的异常分子极可能造成“蛋白质自杀” 。这与皮肤锚原纤维的数量减少和形态异

18、常相一致。然而，与其他胶原疾病相比较，在成年时 DEB 病情变得很轻、大疱消退的表现非常明显。 然而，四个无血缘关系的家系都存在同一缺失突变COL7A1 内的突变 8523del14 导致外显子 115 框内的跳跃，使前型胶原 29 个氨基酸消失、前胶原的修饰加工障碍。皮肤内型胶原滞留但没有明显功能不全，这表明所有前 1()多肽链 NC-2 的裂解并不是锚原纤维形成的先决条件。但是，当没有裂解的前 1()链与另一突变的链聚合时，就会影响锚原纤维的功能。例如，缺失突变与甘氨酸置换（G009R 或 G2043R） 、或与另一等位基因上的 PTC 相组合的复合杂合性先证者，其表型明显加重。而这一现象

19、在其他胶原中没有观察到。引起前型胶原羧基端前肽链滞留的突变只有与另一突变相组合时才具有致病性，但是仅前型胶原多肽滞留的突变就可产生致病性后果，如 Ehlers danlos 综合征。因此，型胶原分子折叠、聚合的机制肯定不同于型胶原，且其超微结构的稳定也与其他胶原不同。型胶原的结构可明显地赋予单倍体和二倍体的构象柔韧性，从而使其具有非凡的调节能力以致于结构发生改变时仍不会引起功能丧失。 6、结语 探讨 DEB 发病的分子机制不仅增长了人们对锚原纤维和基底膜带成分的生物学知识，而且也为今后 DEB 新的治疗方法奠定基础，如体细胞基因治疗。今后成功治疗的进展也取决于人们对基底膜带巨分子形成超微结构、多聚体形成的分子机制和每个分子的独特性等方面的深刻理解。这些知识将不仅有助于深入理解基因遗传病的丰富内涵和复杂性，而且也有助于理解其他遗传性疾病和常见的获得性疾病。