人肝癌细胞在免疫重建前后SCID小鼠中的生长特点.doc

1、人肝癌细胞在免疫重建前后 SCID 小鼠中的生长特点作者：张志培 江逊 黄立军 赵佐庆 施新猷 李六金 师长宏 【关键词】 肝癌细胞 关键词: SCID 小鼠;免疫重建;肝癌细胞;免疫细胞 摘 要:目的 探讨 SCID 小鼠免疫重建及免疫对人肝癌细胞成瘤的影响. 方法 体外培养人肝癌细胞系，接种到 SCID 小鼠和用BALB/c，CBA/N 小鼠外周血淋巴细胞重建的 SCID（B-PBL-SCID 和 C-PBL-SCID）小鼠皮下;监测成瘤状态，测定鼠脾细胞毒杀伤力和免疫重建的免疫球蛋白量，作血清与靶细胞凝集实验. 结果 免疫重建体现了所用小鼠免疫对肿瘤的排斥特点，免疫重建成功;SCID 和

2、 C-PBL-SCID 小鼠 100%成瘤（两瘤体相比 P0.01） ，B-PBL-SCID 出现瘤体后逐渐消失;B-PBL-SCID 和 C-PBL-SCID 脾细胞对靶细胞有一定的杀伤力，B-PBL-SCID的血清能与靶细胞产生凝集反应. 结论 SCID 是建立肿瘤模型和肿瘤免疫研究的良好动物;肝癌细胞在小鼠体内的成瘤率与 T，B 细胞免疫有关. Keywords:SCID mice;immunoreconstitution;hepatocarci-noma cell;immune cell Abstract:AIM To explore the immunoreconstitution

3、of SCID mice and the affection of immunity on hepatocarcinoma cell growth in vivo.METHODS The human hepatocarci-noma cells cultured in vitro were inoculated into the limbs of SCID mice subcutaneously and the immunoreconstituted SCID mice with BALB/c and CBA/N mice peripheral blood lymphocytes（B-PBL-

4、SCID and C-PBL-SCID mice）and their growth situations were monitored.The spleen cells of these mice were harvested in5weeks after inoculation and exam-ined for direct cytotoxicity to the hepatocarcinoma cells（tar-get cells）.The immunoglobulin concentration of B-PBL-SCID mice was surveyed and the seru

5、m agglutination of B-PBL-SCID mice was tested.RESULTS The successfully re-constituted immunity in SCID mice embodied the rejection characteristics of BALB/c and CBA/N mice to the hepatocar-cinoma cells.There was100%carcinoma growth in SCID and C-PBL-SCID mice，while the carcinoma of B-PBL-SCID mice d

6、isappeared after certain time.The spleen cells from B-PBL-SCID and C-PBL-SCID mice displayed certain cytotoxi-city to target cells，but the control group generated no lysis to target cells.The sera immunoglobulin of B-PBL-SCID mice had the level of g L-1 and generated agglutination with the target ce

7、lls.CONCLUSION SCID is good for establish-ing tumor model and studying tumor immune.Carcinoma grows in the mice is correlated with T and B lymphcytes. 0 引言 SCID 小鼠是一种严重联合免疫（T 和 B）细胞缺陷的突变系小鼠，缺乏细胞和体液免疫，对异源性移植物产生的排斥反应很小，有利于肿瘤和肿瘤免疫的研究.国外已较普遍利用 SCID 小鼠进行肿瘤免疫的研究1 ，国内也开张了一些研究2 ，但对免疫重建后的肿瘤免疫研究不够深入和具体.我们用 BA

8、LB/c 和 CBA/N 外周血淋巴细胞重建SCID（B-PBL-SCID 和 C-PBL-SCID）小鼠，将体外培养的人肝癌细胞接种到 SCID，B-PBL-SCID 和 C-PBL-SCID 小鼠的皮下，测定免疫重建后脾细胞毒力和 B 细胞产生的抗体水平，探讨 SCID 小鼠建立肝癌模型特点和免疫重建的免疫细胞与肿瘤生长之间的关系. 1 材料和方法 1.1 材料 人肝癌细胞来源于实验动物中心建立的，经鉴定及 100以上传代的人原发肝癌细胞系（HHCC-9724） 6 ;用含 100mL L-1 的小牛血清、10 万 U L-1 青霉素和 10 万 U L-1 链霉素的 RPMI1640 完

9、全培养液置于 37，50mL L-1 CO2 孵箱中培养，传到一定数量的对数生长期时，用 2.5mg L-1 的胰酶（含 2mg L-1 的 EDTA）消化、离心、调整细胞数后接种到小鼠.C.B-17SCID 小鼠 15 只为解放军军事医学科学院动物中心提供的三级实验动物，体质量 1518g，58wk 龄，用 ELISA 法检测无“渗漏”现象.全部实验小鼠都在无特定病原体（SPF）环境下饲养.BALB/c 和 CBA/N 二级小鼠各 5 只用于重建 SCID 小鼠免疫. 1.2 方法 SCID 小鼠分为 3 组，每组各为 5 只，其中 2 组用于免疫重建. 1.2.1 免疫重建及瘤体测量 在无

10、菌条件下操作，摘除 BALB/c 和CBA/N 小鼠眼球取血，常规 Ficoll 密度法分离淋巴细胞，获得的细胞用RPMI1640 洗涤 2 次（1500 min-1 10） ，重新用 RPMI1640 悬浮，取一滴悬液与一滴 2g L-1 台盼蓝染液混合，于计数板上计数活细胞7，8 ，调整细胞数到 21010 L-1 ，于接种癌细胞 3d 前给 SCID 小鼠ip0.4mL.SCID 小鼠在接种瘤细胞前分别称质量，各鼠接种癌细胞 1wk 后开始，每 wk 同一时间进 SPF 楼，观察肝癌生长情况，长出瘤体用游标卡尺测量，体积根据公式 V=ab2 /2（a-短径，b-长径）计算，同时，SCID

11、小鼠每 wk 称质量.5wk 后处死，瘤体称质量. 1.2.2 SCID 小鼠脾细胞毒杀伤功能检测 接种癌细胞的小鼠和相应正常鼠经脱颈处死，用 750mL L-1 乙醇浸泡，在超净台中无菌取脾脏，研磨制成脾细胞悬液，洗涤后用 100mL L-1 FCS RPMI1640 调整 11010 L-1 ，内加高剂量 IL-2（10 万 U L-1 ）和经 5Gy 照射的肝癌细胞（1109 L-1 ） ，加到 24 孔培养板中，于 50mL L-1 CO2 孵箱中培养诱导 5d.取对数生长期的癌细胞 1109 L-1 ，加 N251 CrO4 3.7MBq 于37孵育 3h（每 15min 轻轻振摇

12、1 次） ，取出用 100mL L-1 FCS RPMI1640 洗涤 3 次（800r min-1 ，5min）重新悬浮，调整细胞数加入96 孔培养板（每孔 100L 含 1104 细胞） ，同时每孔加 100L 不同浓度的效应细胞，每份 3 个复孔，效靶比例为 100 1，50 1，25 1 和 12.5 1.最大释放组加入 10g L-1 Triton X-100100L，自然释放组加 100L的完全培养液，在 37CO2 孵箱中培养 4h.然后每孔取上清液 100 L，于 计数仪上测定 cpm 值，计算:特异性杀伤率（%）=（实验释放 min-1 -自然释放 min-1 ）/（最大释放

13、 min-1 -自然释放 min-1 ）. 1.2.3 测定特异性 Ig 抗体 包被兔抗鼠抗体加入 ELISA 板，100L 孔-1 ，4过夜.取出板子，洗板 3 次（35min ） ，10g L-1 小牛血清白蛋白液 100L 封闭，371h.取板，洗涤液洗板 3 次（35min） ，加入标准品、阴性对照及待测样品，37水浴箱 1h.洗板 35min，加入稀释好的酶标羊抗鼠抗体，371h.洗板 35min，加入显色液，室温1015min，于 EISA 读数仪测的 A 值 450nm，绘制标准曲线，算出检测样品含量.分离荷瘤小鼠和对照鼠血清;把肝癌靶细胞滴定到载玻片上，加入小鼠血清和对照组血清

14、，观察其凝集反应结果，照相. 2 结果 2.1 皮下瘤变化 SCID 小鼠成瘤率达 100%，随时间推移而增大;两种免疫重建 SCID 小鼠有不同的瘤结节表现，B-PBL-SCID 小鼠瘤结节到2wk 后逐渐减小，5wk 全部消失;C-PBL-SCID 瘤结节 3wk 以后有逐渐缩小的趋势，但仍维持一定的大小（Fig1）.5wk 末 SCID 和 C-PBL-SCID 瘤体结分别为（954243）和（12030）mm3 （P0.01）;本实验还有另一现象，SCID 小鼠的体质量随瘤体积增大而减小，SCID 小鼠瘤体和 B-PBL-SCID 的瘤体大小与其各自体质量存在着负线性关系前者 r=-0

15、.995，P0.01，后者 r=-0.953，P0.05.C-PBL-SCID 的皮下瘤体大小与其体质量没明显负线性差异，但也存在背离现象. 图 1 SCID 皮下瘤生长情况 略 2.2 荷瘤小鼠脾细胞对靶细胞杀伤力 在效靶比例 100 1 时有意义，C-PBL-SCID 特异性杀伤率为（7.40.5）%，B-PBL-SCID 为（6.40.6）%（自然释放率约为 8.5%） ，SCID 小鼠只有很小的杀伤作用（Fig2）. 图 2 不同 SCID 小鼠对靶细胞产生的细胞毒性 略 2.3 Ig 含量及与癌细胞的凝集反应 荷瘤 B-PBL-SCID 小鼠产生较高的 Ig 水平，达到 g L-1

16、，Ig 逐渐升高，45wk 基本趋向平稳（Fig3）.荷瘤 B-PBL-SCID 小鼠血清与癌细胞产生凝集反应，荷瘤 SICD 小鼠不与癌细胞产生凝集反应（Fig5，6）. 3 讨论 SCID 小鼠体内未有功能性的淋巴细胞，血清中测不到抗体.根据这一特点，可将肿瘤植到 SCID 小鼠体内，建立肿瘤模型6 .我们将肝癌细胞接种到 SCID 小鼠，肿瘤生长速度快，瘤体结较大，与将肝癌细胞接种到裸鼠相比7 ，SCID 小鼠显得更优越，是建立肿瘤模型更为理想的小鼠.SCID 小鼠可进行免疫重建，我们用 8106 细胞数免疫重建的 B-PBL-SCID 和 C-PBL-SCID 没死亡，再现了两小鼠免疫

17、对肝癌细胞排斥能力，免疫重建成功.但光镜下免疫重建的肝组织出现了炎症反应和肝细胞溶解，说明 SCID 小鼠仍能产生移植物抗宿主疾病（GVHD）.本实验 GVHD 较小，可能是用鼠源性淋巴细胞进行免疫重建，及与细胞数量不高于 107 有关，如用人源性免疫细胞重建 SCID 就可能出现 GVHD，所以用人免疫重建SCID 小鼠时，要注意防止 GVHD 的发生. 图 3图 6 略 肝癌细胞接种到各小鼠时，T，B 细胞俱全的 BALB/c 小鼠免疫排斥肝癌细胞最强，CBA/N 小鼠有较强的排斥力 7，8 .本研究 B-PBL-SCID 的瘤结节到 3wk 开始缩小，5wk 全部消退，而 C-PBL-S

18、CID 小鼠到 5wk 仍有缩小的瘤结节，也就是免疫重建的 SCID小鼠再现了 BALB/c 和 CBA/N 小鼠排斥肝癌细胞的趋势:BALB/c 排斥力大于 CBA/N 小鼠.免疫重建小鼠的脾细胞有一定的杀伤力，即免疫重建 T 细胞有排斥肿瘤的作用;C-PBL-SCID 小鼠的脾细胞毒性大于 B-PBL-SCID 小鼠，表明，T 细胞固然在抗肿瘤的作用中非常重要，但 B 淋巴细胞所产生的抗体以及 B 淋巴细胞对 T 细胞的促进作用是不可忽视的. 参考文献: 1Bonnet D，Warren EH，Greeberg PD，Dick JE，Riddell SR.CD8+ minor histoc

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