人Smad3的shRNA表达载体构建和鉴定.doc

1、人 Smad3 的 shRNA 表达载体构建和鉴定作者：谢桥生 雷小英 王立锋 孟艳玲 王芳 薛茜 温伟红 杨安钢 【摘要】 目的： 构建人 Smad3 的 shRNA 表达载体，运用 RNAi 下调Smad3 基因在肿瘤细胞系中的表达，观察对肿瘤细胞生长的影响. 方法： 化学合成针对人 Smad3 基因的 dsRNA，瞬时转染入 Hela 细胞，检测 RNA干扰效果，筛选有效干扰靶位点；设计并合成针对人 Smad3 基因的 siRNA寡核苷酸链，经退火形成双链后克隆入质粒载体 pSilencerTM3.1H1 hygro，转染入 Hela 细胞，用 hygromycin B 筛选稳定单克隆细

2、胞株，对细胞株行 RTPCR 和 Western Blot 检测，观察 siRNA 对靶基因的抑制效果，进一步研究下调目的分子表达水平以后肿瘤细胞生长的变化. 结果：瞬时转染筛选到了有效的 RNA 干扰靶位点，构建载体后，建立稳定转染的单克隆细胞株，Smad3 mRNA 和蛋白质水平均显著下调，导致肿瘤细胞生长抑制. 结论： 成功构建了针对人 Smad3 高效、特异、作用持久的shRNA 表达载体，转染细胞后可下调 Smad3 的表达，为进一步研究 Smad3的功能和肿瘤的基因治疗奠定了基础. 【关键词】 Smad3；RNA 干扰；遗传载体；肿瘤生长抑制 0 引言 Smad 家族成员是 TGF

3、 信号通路中的重要分子，根据其结构和功能的相似性，可分为三个亚家族，即 RSmads （receptor regulated Smads） ，CoSmads （common Smads） ，和 ISmads （inhibitory Smads）1. Smad3 是 RSmads 中的一个成员，参与细胞增殖、分化、细胞外基质调节、肿瘤细胞迁移，与其功能相近的还有Smad2，Smad1，Smad5，Smad8. 近年来，Smads 信号通路在肿瘤细胞中的作用逐渐引起人们的关注，有望成为肿瘤治疗中的潜在有效靶点2-5. 我们通过瞬时转染 dsRNA（doublestranded RNA，双链 RNA

4、）入 Hela细胞，筛选有效的 siRNA（small interference RNA）序列，并构建shRNA（small hairpin RNA）表达载体，建立持续低表达 Smad3 的稳定细胞株，以期进一步探求 Smad3 下调后对肿瘤生物学性状的影响. 1 材料和方法 1.1 材料质粒载体 pSilencerTM3.1H1 hygro 由西京医院刘家云博士惠赠；大肠杆菌 DH5 、宫颈癌细胞系 Hela 由本实验室保存；细胞培养试剂、TRIZOL Reagent RTPCR 试剂盒、hygromycin B，LipofectamineTM 2000（ Invitrogen 公司） ；牛

5、血清白蛋白（BSA） 、兔抗人 antiSmad3 多克隆抗体（sc8332 ，Santa Cruz 公司） ；兔抗人antiActin 多克隆抗体、HRP 标记羊抗兔二抗（武汉博士德公司） ；NC膜（Millipore 公司） ；BCA 法蛋白定量试剂盒、Western Blot 发光液（Pierce 公司） ；各种限制性核酸内切酶、T4 DNA 连接酶（TaKaRa 公司） ；小量质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、质粒中提试剂盒（Promega 公司）. Western Blot 设备（BIORAD 公司） ；凝胶成像仪（ULTRAVIOLET 公司）；高速离心机（Beckman 公司） ；紫

6、外分光光度计（Ultrospec 2000，Pharmacia Biotech 公司） ；PCR 仪（PTC 200，MJ Research 公司） ；酶联免疫检测仪（Model 500，BIORAD 公司）. 1.2 方法 1.2.1siRNA 的设计根据 RNA 干扰靶位点的设计原则，从 Smad3 mRNA（NM_005902）的编码序列中寻找符合设计特征的靶位点，经 BLAST软件进行同源分析证实为 Smad3 特异性序列后，选择其编码区第941959 位核苷酸为干扰靶位点，由上海吉玛公司合成其 dsRNA 序列，Smad3 正义链：5GCACAUAAUAACUUGGACCdTdT 3

7、 ，反义链：5CGUGUAUUAUUGAACCUGGdTdT3. 由公司提供的阴性对照 dsRNA 与人类基因无同源性，正义链：5UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT3 ，反义链：5AAGAGGCUUGCACAGUGCAdTdT3. 1.2.2shRNA 表达质粒载体的构建按上述靶位点构建 shRNA 表达载体，根据 pSilencerTM3.1H1 hygro 质粒载体的要求设计 1 对能编码 shRNA的寡核苷酸链，正义链：5GATCCGCACATAATAACTTGGACCTTCAAGAGAGGTCCAAGTTATTATGTGCTTTT TTGGAAA3 ，反义链：5AGCTTT

8、TCCAAAAAAGCACATAATAACTTGGACCTCTCTTGAAGGTCCAAGTT ATTATGTGCG3 ；序列两端包含 BamH和 Hind两个酶切位点，交由上海生工合成. 阴性对照质粒为公司提供的针对绿色荧光蛋白（green fluorescent protein, GFP)的干扰载体，正义链：5GATCCGGTTATGTACAGGAACGCATTCAAGAGATGCGTTCCTGTACATAACCTTTTTTGGAAA3 ，反义链：5AGCTTTTTCCA AAAAGGTTATGTACAGGAACGCATCTCTTGAATGC GTTCCTGTACATAACCG3. 取寡核

9、苷酸链制备退火双链 DNA，连接入经 BamH和 Hind双酶切的 pSilencerTM3.1H1 hygro 载体，将连接产物转化 DH5 感受态细胞，在氨苄青霉素阳性琼脂板上长出菌落，挑取单个菌落送交北京奥科生物公司测序. 1.2.3 细胞转染及单克隆细胞株的筛选常规培养 Hela 细胞于含 100 mL/L 胎牛血清的 RMPI 1640，50 mL/L CO2 中，瞬时转染前 24 h，接种细胞于 6 孔板中（2105/孔） ，按 LipofectamineTM2000 操作说明转染Hela 细胞. 稳定转染筛选单克隆细胞株时，于转染前 24 h 接种细胞于 6孔板中（5105/孔）

10、 ，转染后细胞培养于含 100 mL/L 胎牛血清的 RMPI 1640，50 mL/L CO2，150 mg/L hygromycin B 中，2 wk 左右长出单个细胞克隆集落，用胰酶消化，用有限稀释法再一次筛选出单克隆细胞株，在 hygromycin B 筛选压力下，经历 3 wk 扩大培养后，得到持续低表达Smad3 的单克隆细胞株. 1.2.4RTPCR 检测基因 mRNA 表达水平在 6 孔板中，每孔加入TRIZOL Reagent 1 mL 提取细胞总 RNA，操作按试剂说明书进行，经逆转录得到 cDNA. 用专业软件设计引物，内参照 actin 上游引物：5TGCGCAGAAA

11、ACAAGATGAGATT3 ；下游引物：5TGGGGGACAAAAAGGGGGAAGG3. Smad2 上游引物：5TTCCGCCTCTGGATGACTA3 ；下游引物：5TTTCTACCGTGGCATTTCG3. Smad3 上游引物：5 CACGCAGAACGTCAACAC3 ；下游引物：5GTGAAGCCATCCACAGTC3. 1.2.5Western Blot 检测基因蛋白质表达水平加入细胞裂解液RIPA，提取细胞总蛋白，用蛋白定量试剂盒检测细胞裂解液蛋白浓度后，行 SDSPAGE ，每孔加样 100 g，转膜，用 50 g/L BSA 封闭过夜，一抗 4孵育 12 h，二抗室温孵

12、育 2 h，化学发光按操作说明进行，其中antiSmad3 按 1200 稀释，antiActin 按 1400 稀释，二抗按12000 稀释. 1.2.6MTT 法检测 Hela 细胞的增殖将稳定建株的 Hela 细胞接种于 96孔板中（2103/孔） ，每孔加入 5 g/L MTT 溶液 20 L ，继续培养 4 h ，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入 150 L DMSO ，振荡10 min ，使紫色结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪上测定各孔 A490 nm，以时间为横轴，A490 nm 为纵轴绘制细胞生长曲线. 2 结果 2.1 瞬时转染 dsRNA 后细胞内 Smad3 的

13、表达以 actin 和 Actin 作为内参照，实验组较对照组的 Smad3 mRNA 和蛋白质水平均下降（图 1）. 2.2shRNA 表达质粒载体的鉴定测序结果表明载体构建成功（图 2）. 2.3 稳定建株细胞内 Smad3 的表达转染 shRNA 组与阴性对照组相比，Smad3 mRNA 和蛋白质水平均下降，Smad2 水平没有变化，与瞬时转染的结果相一致（图 3）. EC：实验对照，有脂质体，无 dsRNA；NC：阴性对照；RNAi：转染dsRNA 组. 2.4Hela 细胞的增殖持续低表达 Smad3 的实验组与阴性对照组相比，细胞生长受抑制（图 4）. 图 4Hela 细胞生长曲线

14、 3 讨论 RNA 干扰(RNA interference, RNAi)是双链 RNA 介导的、序列特异的转录后基因沉默(posttranscriptional gene silencing, PTGS)现象，广泛存在于线虫、果蝇、植物、真菌及哺乳动物等多种生物体中，具有特异性和高效性，被广泛用于基因功能鉴定和基因治疗研究6. 经过化学修饰的 dsRNA 分子质量小，瞬时转染入细胞中，作用效果显著，但是其效果与细胞转染效率密切相关，且作用不持久，只能反映暂时的基因表达下调7-8. 构建质粒载体，建立稳定单克隆细胞株，在宿主细胞内持久产生 shRNA，发挥 RNA 干扰效应9 ，能长时间降低目的

15、蛋白在细胞内的表达，进而研究宿主细胞一系列细胞生物学行为，以及目的蛋白上下游分子的变化. 我们运用了 dsRNA 筛选有效干扰靶位点速度快的特点，筛选到有效的干扰序列，再结合稳定转染建株的优势，实现了对 Smad3 分子高效、持久的下调表达. 在图 1 和图 3 中，因为Smad2 和 Smad3 功能相近，同源性高，检测它没有发生变化，说明针对目的分子 Smad3 的 RNA 干扰是特异的. Smad 家族分子，很久以来被认为是肿瘤抑制基因10 ，随着研究的深入，发现其作用是双重的，Smad3 作为 TGF 信号通路中的重要分子，因为作用广泛而备受重视. 在肿瘤进展中，它的活化调节一系列与肿

16、瘤进展相关基因的转录，引起肿瘤细胞迁移能力增强，恶性程度增加，这些都与肿瘤患者的预后密切相关；然而它发挥作用有组织来源差异性，不同来源的肿瘤细胞中，有着截然相反的效应，这是因为调节基因转录时，还要和核内其他转录因子以形成复合物的方式与顺式作用元件相结合，这是个复杂的过程，探索这些现象，对于肿瘤基因治疗有指导意义2-3, 5, 11. 我们观察到，在稳定建株的细胞中 Smad3 持久低水平表达，Hela 细胞生长受抑制，进一步探索其中的分子机制，研究肿瘤生物学行为的变化，对于肿瘤基因治疗有重要意义. 【参考文献】 1 Liliana A, Lee H. The SmadsJ. Genome Bi

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18、HH. NonSmad TGF signalsJ. J Cell Sci, 2005,118:3573-3584. 5 Anita BR, Fang T, Stacey DB, et al. Smad3 is key to TGF mediated epithelialtomesenchymal transition, fibrosis, tumor suppression and metastasisJ. Cytokine Growth Factor Rev, 2006,17:19-27. 6 Novina CD, Sharp PA. The RNAi revolutionJ. Nature

19、, 2004,430:161-164. 7 Elbashir SM, Harborth J, Lendeckel W, et al. Duplexes of 21 nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cellsJ. Nature, 2001,411:494-498. 8 Dykxhoorn DM, Novina CD, Sharp PA. Killing the messenger: Short RNAs that silence gene expressionJ. Nat Rev Mol Cell Bi

20、ol, 2003, 4:457-467. 9 Brummelkamp TR, Bemards R, Agami R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cellsJ. Science, 2002, 296:550-553. 10 Kay M. Tumor suppressor genesJ. Curr Opin Genet Dev, 2000,10:81-93. 11 Leo AG, Griet V, Danny H, et al. Smads and chromatin modulationJ. Cytokine Growth Factor Rev, 2005,16:495-512.