人CD59 RNAi逆转录病毒载体系统的构建与鉴定.doc

1、人 CD59 RNAi 逆转录病毒载体系统的构建与鉴定作者：石学香 高美华 臧金林 【摘要】 目的 利用 siRNA 表达载体法构建并筛选携带针对 CD59 基因pSUPER retro RNAi 逆转录病毒载体及稳定产毒的细胞克隆。方法 用DNA 重组技术，将 3 条 60 bp 能转录产生靶向 CD59 小发夹 RNA（shRNA）的寡核苷酸序列定向克隆入逆转录病毒载体 pSUPER retro，脂质体法转染包装细胞系 Phoenix A，建立产生逆转录病毒的细胞克隆。结果 重组载体经 PCR 及限制性内切酶酶切鉴定初步成功后测序序列正确；重组载体转染包装细胞，可表达绿色荧光蛋白，表明包装

2、成功。结论 特异性沉默 CD59 基因的 pSUPER retro RNAi 逆转录病毒载体以及稳定产毒的细胞系构建成功，为后续进行肿瘤细胞的研究奠定了基础，可望为肿瘤治疗开辟新途径。 【关键词】 RNA,双链；抗原,CD59；转染；逆转录病毒载体 CD59 是补体终末段的一种调节蛋白，具有抑制补体攻膜复合物的形成，保护细胞免遭补体介导的溶细胞作用。FONSATTI 等1研究显示，CD59与肿瘤的生长失控及转移密切相关。由于在大多数实体瘤细胞膜表面存在或者高表达 CD59 等一系列的膜补体调节蛋白，使得肿瘤细胞逃脱了自身的免疫监视以及靶向单克隆抗体治疗中由补体介导的溶细胞作用，免疫逃逸是导致众

3、多肿瘤治疗方案失败的重要原因2,3。目前，在实体肿瘤的免疫治疗研究中，一个更加有效的策略是使肿瘤细胞膜上的补体调节蛋白失活或不表达。本研究选择 CD59 作为靶基因，应用 RNA 干涉（RNAi）技术，构建携带针对 CD59 的 pSUPER retro neo+gfp 重组载体，以特异性沉默肿瘤细胞中 CD59 基因表达，观察小发夹 RNA（shRNA）对靶基因表达的抑制作用，以及靶基因沉默对肿瘤细胞凋亡和增殖的影响。 1 材料与方法 1.1 材料 逆转录病毒包装细胞 Phoenix A 及 pSUPER retro neo+gfp 质粒均由我院罗兵教授惠赠，大肠杆菌 JM109 为本实验室

4、保存菌种，靶向 CD59 的60 bp oligos 由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。限制性核酸内切酶、T4 DNA 连接酶购自 Fermentas 公司；E.Z.N.A.Gel Extraction kit 购自美国 OMEGA 公司。 1.2 方法 1.2.1 靶向 CD59 基因寡核苷酸的设计 应用美国 Oligo Engine 公司提供的双链 RNA（siRNA）设计软件，将 CD59 的基因序列号输入后，通过 Blast 搜索确认与人的基因序列无同源性，选出 3 条序列（分别为218236 bp，261279 bp，318336 bp）作为实验组。按照 pSUPER质粒说明书

5、中构建发夹状短链 RNA 的原则，设计序列分别为：T1 组，5GATCCCCGCGTGTCTCATTACCAAAGTTCAAGAGACTTTGGTAATGAGACACGCTTTTTA3 ，As:5AGCTTAAAAAGCGTGTCTCATTACCAAAGTCTCTTGAACTTTGGTAATGAGACACGCGGG3 ；T2 组，5GATCCCCGTGTTGGAAGTTTGAGCATTTCAAGAGAATGCTCAAACTTCCAACACTTTTTA3 ，As:5AGCTTAAAAAGTGTTGGAAGTTTGAGCATTCTCTTGAAATGCTCAAACTTCCAACACGGG3 ；T3

6、组，5GATCCCCTGAGCTAACGTACTACTGCTTCAAGAGAGCAGTAGTACGTTAGCTCATTTTTA3,As:5AGCTTAAAAATGAGCTAACGTACTACTGCTCTCTTGAAGCAGTAGTACGTTAGCTCAGGG3 。同时设计一段错义的 19 nt 作为对照:C组，5GATCCCCAGACTTGACTCCTGTCGAATTCAAGAGATCTGAACTGAGGACAGCTTTTTTTA3 ，As:5AGCTTAAAAAAGACTTGACTCCTGTCGAATCTCTTGAATCTGAACTGAGGACAGCTTGGG3 。 1.2.2 重组载体的构

7、建 本研究选用美国 Oligo Engine 公司的pSUPER retro neo+gfp 质粒作为载体，该载体有 Bgl 和 Hind 两个酶切位点，两位点之间为长 983 bp 的填充序列，将该填充序列切下后，与上述合成的具有 Bgl 和 Hind 黏性末端的 60 nt 的寡核苷酸双链连接，构成重组质粒。 1.2.3 重组载体的鉴定 PCR 初步验证重组载体的正确性，设计一对引物，扩增产物为包括插入序列及其两侧部分碱基的一段长度为 395 bp 的核苷酸，引物序列如下: pSUPERa:5CCTTTATCCAGCCCTCACTC3 ，pSUPERs:5AGACTGCCTTGGGAAAA

8、GCG3 。分别以重组质粒 pSUPERsiCD59 及空质粒为模板进行 PCR 反应。阳性克隆可观察到长为 395 bp 条带，而空质粒可观察到长 1 318 bp 条带。用 EcoR和 Hind 双酶切重组质粒pSUPERsiCD59 以及对照空质粒，37 水浴过夜，次日各取 10 L 于10 g/L 的琼脂糖凝胶中电泳，在凝胶成像系统中观察电泳结果。阳性克隆可观察到长为 281 bp 条带,而空质粒可观察到长为 1 204 bp 条带。为进一步验证插入序列的准确性，把碱裂解法提取的质粒 DNA 及过夜摇菌的产物送上海生物工程有限公司测序。 1.2.4 转染包装细胞系 Phoenix A

9、双嗜性逆转录病毒包装细胞系Phoenix A，培养液为含体积分数 0.10 胎牛血清、105 U/L 青霉素、100 g/L 链霉素的 DMEM，于 37 ，含体积分数 0.05 的 CO2 温箱中培养。当细胞汇合度达 80%90%时，按说明书利用脂质体 Lipofectine 2000（Invitrogene）将重组质粒 pSUPERsiCD59 导入 Phoenix A 细胞，48 h 后，在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光。 2 结果 2.1 pSUPER retro neo+gfp 质粒 Bgl 和 Hind 双酶切结果 该质粒全长 8 371 bp，Bgl 和 Hind 两酶切位点之间的

10、序列长为 983 bp，用 Bgl 和 Hind 将质粒双酶切后，可观察到长 983 bp和 7 388 bp 的 DNA 片段。 2.2 重组质粒的 PCR 鉴定 取 4 L 的 PCR 反应产物行琼脂糖凝胶电泳，并取空质粒为阴性对照。电泳结果显示，重组质粒可观察到长 395 bp 的条带，而空质粒可观察到长为 1 318 bp 的条带。见图 1。 2.3 重组质粒的酶切鉴定 选取 ALB 平板上的可疑菌落摇菌后提取质粒，用 EcoR和 Hind 双酶切，取 10 L 酶切产物行琼脂糖凝胶电泳，并选取空质粒作为对照。电泳结果显示，空质粒和重组质粒均观察到长 7 167 bp 的 DNA 条带

11、，但空质粒酶切产生的较小的 DNA 片段长为 1 204 bp，而重组质粒pSUPERsiCD59 则长为 281 bp。见图 2。 2.4 靶序列鉴定 重组质粒 pSUPERsiCD59 的测序结果与我们设计合成的T1、T2、T3、C 组的序列完全一致，结果表明长 60 bp 的寡核苷酸插入pSUPER 载体，靶向 CD59 基因的 pSUPERsiCD59 载体构建成功。 2.5 逆转录病毒载体的包装 重组质粒 pSUPERsiCD59 经脂质体法转染包装细胞 Phoenix A，48 h 后在倒置荧光显微镜下观察到绿色荧光，说明包装出的重组逆转录病毒具有感染性。 3 讨论 CD59 是近

12、年来发现的一种相对分子质量为 18 00020 000 的补体调节蛋白，其最重要的功能是通过阻止补体攻膜复合物(MAC)的装配以保护宿主细胞免受补体溶破4。近年来的研究发现，在大多数实体瘤细胞膜表面存在或者高表达 CD59 等一系列的膜补体调节蛋白，提示 CD59 与肿瘤的失控性生长和恶性转化密切相关。目前，在实体肿瘤的免疫治疗中，一个更加有效的策略是使肿瘤细胞膜上的补体调节蛋白失活或不表达。 图 1 重组质粒 PCR 反应产物鉴定电泳（略） M:Maker DL2000;:分别为重组质粒pSUPERsiCD59T1 、T2、T3、C;：空质粒;：阴性对照 图 2 EcoR和 Hind 双酶切

13、重组质粒鉴定电泳 M: Maker DL2000 、:空质粒;:重组质粒pSUPERsiCD59T1 、T2、T3、C RNAi 是自然界中普遍存在的一种重要的转录后基因沉默现象。文献报道，用人工合成 1923 nt siRNA 直接转染或 shRNA 经载体介导后转染靶细胞可诱导 RNAi，能产生对相应序列 mRNA 的特异性降解5。鉴于CD59 基因的过度表达是肿瘤免疫逃逸导致众多肿瘤治疗方案失败的重要原因，故可作为选择性干预的靶基因。目前，制备 siRNA 的方法主要有两类，即体外制备和体内表达，两者最大的不同在于前者直接作用于RNA，而后者的对象则是 DNA。根据具体工具不同可进一步划

14、分为 5 种RNAi 实验方法，即化学合成法、体外转录法、制备 siRNA 混合物、siRNA表达盒子和 siRNA 表达载体法。siRNA 表达载体法的特点是由 RNA 聚合酶启动子（pol）启动体内的转录，另外有 45 个 T 组成的转录终止位点，常用 RNA 聚合酶启动子包括人和鼠的 U6 启动子以及人 H1 启动子等3 种。选择 RNA pol是因为它总是在离启动子固定距离的位置开始转录，遇到 45 个连续的 U 即在转录终止位点的第 2 个碱基处终止，非常精确6。由于质粒可以在细胞内复制扩增，这种带有抗生素抗性标记的载体抑制基因，表达的效果可持续几周甚至更长，这使之成为适用于较长周期

15、研究的方法。 本文用逆转录病毒转染体系构建针对 CD59 的 shRNA 转录载体。携带靶序列 pSUPERsiCD59 载体是带有新霉素抗性基因和绿色荧光蛋白编码基因的逆转录病毒载体，该载体带有依赖 RNA 聚合酶的 H1 启动子，可转录生成针对靶基因的 shRNA，在体内再加工生成双链的小干涉 RNA，进而降解相应的靶 mRNA。逆转录病毒能感染分裂期细胞，使目的基因稳定地整合到靶细胞基因组，能长期表达，而且不产生辅助病毒，具有很好的安全性7。本研究通过脂质体转染双嗜性包装细胞 Phoenix A，包装成功的 Phoenix A 细胞在倒置荧光显微镜下可观察到绿色荧光，说明转染成功，获得可

16、以感染靶细胞的逆转录病毒。该病毒能产生针对靶基因CD59 的 shRNA，使靶基因的 mRNA 降解，为更深入地探讨 CD59 基因沉默对 CD59 阳性肿瘤细胞凋亡和增殖分化影响，进而为用于 CD59 相关肿瘤的治疗奠定了实验基础。 【参考文献】 1FONSATTI E, ALTOMONTE M, CORAL S. Emerging role of protectin (CD59) in humoral immunotherapy of solid malignanciesJ. Clin Ter, 2000,151(3):187193. 2FISHEISON Z, DONIN N, ZELL

17、 S, et al. Obstacles to cancer immunotherapy: expression of membrane complement regulatory proteins (mCRPs) in tumorsJ. Mol Immunol, 2003,40(2/4):109123. 3DEN C, FONSATTI E, SIGALOTTI L, et al. Recombinant transmembrane CD59 (CD59TM) confers complement resistance to GPIanchored protein defective mel

18、anoma cellsJ. J Cell Physiol, 2002,190(2):200206. 4MERI S, MORGAN B P, DAVIES A, et al. Human protectin (CD59), an 18,000-20,000 MW complementlysis restricting factor, inhibits C5b8 catalysed insertion of C9 into lipid bilayersJ. Immunology, 1990,71:19. 5BRUMMELKAMP T R, BERNARDS R, AAMI R, et al. A

19、 system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cellsJ. Science, 2002,296: 550. 6SUI G, SOOHOO C, AFFAREL B, et al. A DNA vectorbased RNAi technology to suppress gene expression in mammalian cellsJ. Proc Natl Acad Sci USA, 2002,99:55155520. 7徐华敏,姜宏,谢俊霞. 细菌内同源重组构建携带人 DMT1 基因的重组腺病毒J. 青岛大学医学院学报, 2008,44:189191.