人lrg在大肠杆菌中的表达及表达产物的免疫血清制备和鉴定.doc

1、人 lrg 在大肠杆菌中的表达及表达产物的免疫血清制备和鉴定作者：杜可军，柴玉波，常文辉，侯理朝，张晓楠，陈南春，林树新，陈苏民 【关键词】 免疫血清 【Abstract】 AIM: To express human lrg in E.coli and to obtain an anti-Lrg immune serum. METHODS: lrg cDNA was cloned into pcTAT vector. The fusion proteins were expressed in E.coli and purified by Ni-NTA column and SDS-PAGE.

2、Rabbits were immunized with preliminary purified Lrg protein and reinforced three times. The antiserum was collected. RESULTS: Antiserum against Lrg was obtained in immunized rabbits and its titer was more than 11000 proven by ELISA and Western Blot. The purified Lrg protein could get across membran

3、es of Papilla Dental Cells within 30 min. Immunohistochemical test with this antiserum showed that Lrg was a cytoplasmic protein and rabbit antiserum against human Lrg protein could be used in eukaryotic cell and normal tissues. CONCLUSION: The immune serum specific against Lrg is obtained, which ca

4、n be used in normal tissues and cells. 【Keywords】 lrg; affinity purification; immune sera 【摘要】 目的： 在大肠杆菌表达人 lrg，制备鉴定人 Lrg 免疫血清. 方法： 构建 pcTATlrg 重组表达质粒，并在大肠杆菌中诱导表达相应的融合蛋白；对表达的融合蛋白采用镍柱和 SDSPAGE 纯化；以纯化蛋白作为免疫抗原，对新西兰白兔实施多次免疫（间隔时间分别为 1 mo, 3 wk, 2 wk）. 结果： 获得兔抗人 Lrg 免疫血清. 经过 ELISA 和 Western Blot 检测，效价在 11

5、000 以上. 真核细胞实验表明，6HisTATLrg 蛋白具有良好的穿透性,可以在 30 min 内从培养液进入细胞质; 免疫组化实验表明 Lrg 是一种胞质蛋白; 兔抗人 Lrg 免疫血清可有效应用于细胞和组织的检测. 结论： 制备得到兔抗人 Lrg 免疫血清，为 lrg 的功能研究打下基础. 【关键词】 人 lrg 基因；亲和纯化；免疫血清 0 引言 人 lrg 基因是一种脂多糖应答基因. 系采用基于 PCR 的改良消减杂交技术1 ，用脂多糖刺激人牙髓细胞, 克隆得到并登陆 GenBank 的新基因2,3, 具体功能还不清楚. 生物信息学分析表明，人 lrg 基因的开放读框约 558 b

6、p, 预计编码的蛋白质包含 186 个氨基酸；编码的序列中包含 2 个相互重叠的亮氨酸拉链结构和 1 个螺旋-转角-螺旋结构3, 而亮氨酸拉链结构是 DNA 结合蛋白的特征性结构. 因此，对人 lrg 基因的研究既有线索可寻,又可以采用一些较新的方法4,来加快研究进度. 而深入研究 Lrg 在体内组织细胞分布特点及其功能，需要高效价的 Lrg抗体. 为此，我们在大肠杆菌中融合表达了人 Lrg 蛋白, 并对6HisTATLrg 初步纯化. 用纯化后的蛋白，免疫新西兰大白兔, 以获得高效价的抗 Lrg 血清. 1 材料和方法 1.1 材料 重组质粒 pUC19lrg 由本室构建3; BL21(DE

7、3) 菌种和 pcTAT 载体由本室保存. DNA marker DL2000 购于 TaKaLa 公司. PCR 引物由上海博雅公司合成. 成年雄性新西兰大白兔 1 只(1.2 kg)由第四军医大学实验动物中心提供. HRP 标记的羊抗兔二抗购自 Santa Cruz Biotechnology; DAB，NBT/BCIP 由 Sigma 公司提供 . SABCFITC、免疫组化检测试剂盒由武汉博士德公司提供. 1.2 方法 1.2.1 人 lrg 的扩增和克隆 PCR 反应体系中上下游引物 P1，P2 各 20 pmol, 上游引物 P1 为 AAGGTACCATGAAACAGCAAGAA

8、GTACAAC，含有 Kpn酶切位点; 下游引物 P2 为 AACTCGAGCACATCAAGGAACCATCGTC，含有 Xho酶切位点. 模板 pUC19lrg 0.02 g , 10PCR buffer 5 L, 10 mmol/L dNTP 1 L， pfu polymerase 34 nkat. PCR 反应参数为 95 变性 15 s, 56 退火 40 s，72 延伸 40 s，共 30 个循环. 1.2.2 人 lrg 原核表达载体的构建利用 PCR 产物纯化试剂盒对上述PCR 产物进行纯化. 纯化的扩增产物用 Kpn, Xho进行双酶切，pcTAT 载体进行同样的双酶切. 1

9、6连接目的基因与载体片段, 转化感受态细胞, 挑克隆, 提取质粒, 进行 Kpn和 Xho双酶切鉴定. 1.2.3 人 Lrg 融合蛋白的表达纯化和免疫血清的制备 pcTATlrg 转化入 BL21(DE3)感受态细胞, 用 200 mL LB(Amp+)培养, 1 mmol IPTG 诱导 4 h, 收集细菌. 120 g/L SDSPAGE 分析. 用 Ni 柱对超声裂解诱导细菌上清进行纯化, 120 g/L SDSPAGE 分析. 并用 SDSPAGE 分离纯化后的融合蛋白. 将切下的目的蛋白条带研碎,溶于生理盐水. 采用背部皮下多点注射,免疫新西兰大白兔(以下同), 1 mo 后加强免

10、疫. 3 wk 重新加强免疫. 2 wk 后再强化 1 次. 于第 4 次加强免疫后 7 d 取兔血清. 1.2.4ELISA 检测免疫血清的效价5初步纯化的 6HisTATLrg 蛋白包被 ELISA 板, 间接 ELISA 法检测兔抗人 Lrg 免疫血清的效价. 一抗为11000 兔抗人 Lrg 免疫血清(对照组使用未免疫兔血清); 二抗为12000 HRP 标记的羊抗兔 IgG ; TMB 显色，BioRad 自动酶标仪测定. 1.2.5Western Blot 检测免疫血清效价6初步纯化的 6HisTATLrg融合蛋白进行 SDSPAGE 分离,电转移法将相应蛋白转移到硝酸纤维素滤膜上

11、，用 10 mL 50 g/L 的脱脂奶粉封闭. 一抗为 11000 兔抗人 Lrg 免疫血清(对照组使用未免疫兔血清)，二抗为 15000 碱性磷酸标记的羊抗兔 IgG, 显色试剂为 NBT/BCIP. 1.2.6SABCFITC 染色检测免疫血清的效果爬片培养牙乳头细胞,将初步纯化的 6HisTATLrg 融合蛋白加入到培养液中. 30 min 后取出细胞爬片, PBS 洗涤, 多聚甲醛固定、正常山羊血清封闭, 分别加入 11000 兔抗人Lrg 免疫血清(对照组使用未免疫兔血清)、12000 生物素化的羊抗兔IgG, 荧光素染料 SABCFITC, 奥林巴斯荧光显微镜观察. 1.2.7

12、免疫组化检测免疫血清的效果对人睾丸组织进行常规石蜡切片,用免疫组化检测试剂盒进行染色. 一抗为稀释度 11000 的兔抗人 Lrg 免疫血清; 二抗为 13000 稀释的羊抗兔 IgG. 未免疫兔血清作为阴性对照. DAB 显色,常规脱水,透明,中性树脂封片. 2 结果 2.1 人 lrg 的扩增和克隆以 pUC19lrg 为模板，利用设计的引物 PCR扩增 lrg 基因. 扩增产物经 10 g/L 琼脂糖凝胶电泳分析,可见约 1000 bp目的条带（Fig 1） ，与预期大小相符. 2.2 人 lrg 原核表达载体的构建融合表达载体 pcTATlrg 进行 Kpn和 Xho酶切鉴定. 酶切产

13、物经 10 g/L 琼脂糖凝胶电泳分析,可见约1000 bp 的目的条带（Fig 2） ，与预期大小相符. 2.3 人 Lrg 融合蛋白的表达纯化和免疫血清制备经 IPTG 诱导的转化pcTATlrg 细菌表现目的蛋白 Mr 为 25103,占菌体蛋白总量的 42%（Fig 3）. 经 Ni 柱纯化上清蛋白后,该目的蛋白占菌体蛋白总量的 46%（Fig 3）. 将 Ni 柱纯化后的蛋白进行 SDSPAGE 二次纯化（Fig 4） ，切下相应的目的蛋白条带，生理盐水溶解，免疫新西兰白兔. 2.4ELISA 检测免疫血清的效价酶标仪测量 A280 nm 值(平均数)为: 空白孔 0.035, 11

14、000 抗体孔 0.177. 二者之比大于 5，参考试剂盒规定，表明免疫新西兰大白兔所产生的免疫血清效价在 11000 以上. 2.5Westernblot 检测免疫血清效价诱导后的细菌有预期大小 (Mr 为25103) 的特异性条带(Fig 5), 同时未免疫兔血清没有表达相应的蛋白条带. 2.6SABCFITC 染色检测免疫血清效果与对照组(Fig 6A)相比，加入6HisTATLrg 融合蛋白的牙乳头细胞在胞质内呈现明显的绿色荧光(Fig 6B) . 表明 6HisTATLrg 融合蛋白在 30 min 内进入细胞，而本实验制备的免疫血清可有效应用于真核细胞的检测. 2.7 免疫组化进行

15、免疫血清的检测加未免疫兔血清的睾丸间质细胞胞质呈蓝色 (Fig 7A) ；加兔抗人 Lrg 免疫血清的睾丸间质细胞胞质内有棕黄色免疫反应阳性颗粒(Fig 7B). 说明 Lrg 蛋白位于正常睾丸组织睾丸间质细胞的胞质内. 3 讨论 近年来内毒素血症的研究在危重医学领域中十分活跃，对其发病机制的认识也在不断深入. 脂多糖（LPS）是一种内毒素，大量实验表明，LPS、脂多糖结合蛋白(LBP)和脂多糖受体系统(CD14)参与了炎症反应的病理生理过程7. LPS 在细胞表面以 LPSLBPCD14 三体复合物的形式活化 TLR4 信号传导途径，通过一系列胞内分子的相互作用，产生炎性因子（如 IL1，T

16、NF 等） ，导致炎症反应，甚至出现 DIC 和 MOD8. LPS 是机体炎症反应的重要触发剂， 因此，探讨 LPS 刺激后应答基因的功能，尤其是新发现基因的功能，研究其在 LPS 信号传导途径中的作用部位和作用性质，有助于阐明炎症发生的分子机制. 我们课题组自从成功克隆 lrg 基因并登录 GenBank1,3以来，对该基因的功能展开了初步研究. 生物信息学分析表明，lrg 基因编码的蛋白可能是一种 DNA 结合蛋白. 本课题组的前期实验表明，lrg 基因作为一种 LPS 应答基因，会对真核细胞的细胞周期发生一定影响（资料待发表）. 尽管实验取得了一定进展，但该基因更多功能尚有待阐明. 利

17、用课题组设计的引物，PCR 得到了长 1000 bp 的产物，与预期大小相符. 该片段不仅包括了 lrg 基因的编码区，也包括了 lrg 基因下游的非编码区序列. 为了进一步研究 lrg 基因的功能，需获得针对 Lrg 蛋白的特异性抗体，本室采用初步纯化后的 6HisTATLrg 融合蛋白免疫新西兰大白兔，获得了兔抗人免疫血清. ELISA 和 Western Blot 检测表明，其效价在 11000以上; 并且具有比较高的特异性. 我们采用的原核表达载体是 pcTAT. 该载体采用 T7 启动子，带有6His 的纯化标签以及 HIVTAT 部分基因序列. HIVTAT 的部分基因序列编码 1

18、1 个氨基酸，可以快速穿过所有哺乳动物的细胞膜9-11 ；6His 基因编码 6 个氨基酸. 本实验成功地将 Lrg 蛋白与 6His 纯化标签以及HIVTAT 蛋白的基因进行了重组，获得了 6HisTATLrg 融合蛋白的基因. 重组基因编码的融合蛋白含 216 个氨基酸. 预计该蛋白 Mr 为（2026）103. SDSPAGE 表明，本研究表达的融合蛋白与预期大小相符. 通过蛋白融合，6HisTATLrg 同样获得了快速穿膜特性，可在 30 min 内迅速从培养液穿过细胞膜到达牙乳头细胞的胞质. 这种快速穿膜特性对于研究该基因在真核细胞内的功能具有非常重要的意义. 我们采用 NiNTA

19、纯化系统12 ，专门用于纯化含有 6His 标签的重组蛋白，具有较高的纯化效率，初步纯化了 Lrg 蛋白. 初步实验表明，我们获得的纯化蛋白和免疫血清,纯度和产量足以应用于 lrg 的组织分布和功能研究. SABCFITC 实验表明，在牙乳头细胞中，加入的 Lrg 蛋白在胞质中均匀分布. 而上述结果与免疫组化实验显示的 Lrg 在睾丸组织的分布结果一致,从而验证了实验结果的可靠性. 【参考文献】 1 Chai YB, Zhao ZL. Improved PCRbased subtractive hybridization, a shortcut to clone cell differenti

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