肾康注射液对肾小球系膜细胞增殖及自分泌FN的效应.doc

1、肾康注射液对肾小球系膜细胞增殖及自分泌 FN 的效应作者：李锋，王汉民，行利，王长海，程庆砾，叶传蕙 【关键词】 肾康注射液 【Abstract】 AIM: To explore the mechanism of ShenKang Injection (SKI) on prohibiting glomerulosclerosis (GS) so as to provide fresh evidence for clinical application of SKI in treating chronic renal failure (CRF). METHODS: Using serumphar

2、macological test of Chinese herbs, the effects of SKI on the proliferation in cultured human glomerular mesangial cells (GMC) and the level of fibronectin (FN) secretion in cultured GMC were observed. RESULTS: SKI and serum with SKI significantly inhibited the proliferation and the level of secretin

3、g FN in cultured GMC in a concentrationdependent manner (P0.01, P0.05). With the prolonging of stimulating time, the inhibitory effects SKI increased on the proliferation and the level of FN, but the effects of serum with SKI decreased on the proliferation and the level of FN. CONCLUSION: The effect

4、s of SKI on GMC differ from those of serum with SKI. It is indicated that the effective mechanism of SKI is complicated and is related to SKI metabolism. 【Keywords】 Shenkang injection; glomerular mesangial cell; fibronectin 【摘要】 目的： 探讨肾康注射液（SKI）阻抑肾小球硬化（GS） ，防治慢性肾功能衰竭（CRF）的部分作用机制，为 SKI 临床应用提供依据. 方法：

5、采用血清药理学实验法，观察 SKI 对体外培养人肾小球系膜细胞（GMC）增殖及其自分泌纤维连接蛋白（FN）水平的影响. 结果： SKI 及其含药血清对 GMC 增殖、自分泌 FN 有明显抑制作用（P0.01, P0.05）,呈剂量或 SKI 血药浓度与效应依赖性；但随刺激时间延长，其作用存在差异，即对增殖的抑制效应：SKI 呈递增趋势、而 SKI 含药血清则呈递减趋势，对 FN 水平的抑制效应则相反. 结论： SKI 经机体代谢，药理效应的不一致性，提示 SKI 含药血清可能出现提高 FN 降解酶活性的新物质，或存在降解 FN 的某种活性成分. 【关键词】 肾康注射液；肾小球系膜细胞；纤维连接

6、蛋白 0 引言 肾康注射液(Shenkanginjection,SKI)为纯中药复方制剂，具有“降逆泻浊、益气活血”功效，研究显示：SKI 对肾小球系膜细胞（glomerular mesangial cell, GMC）的增殖及自分泌 IL1 有明显抑制作用. 但 SKI 含药血清对 GMC 增殖及其自分泌纤维粘连蛋白(fibronectin，FN)水平影响如何未见报道. 我们的实验初步揭示 SKI 及其含药血清对 GMC 的效应异同，为该制剂临床应用提供初步依据. 1 材料和方法 1.1 材料 SKI：20 mL/支(含生药量 6 g，批号：970718） ，成都中医药大学附属医院肾病研究室

7、提供；肝素钠注射液：购于解放军总医院药剂科；雄性 Wistar 大鼠 8 只，体质量（23020） g，购于解放军总医院实验动物中心；肾组织来源：配型不符的成人移植肾；有关 GMC 培养和 FN 检测试剂及器械由解放军总医院肾内科实验室提供. 1.2 方法新鲜肾组织用无菌 4生理盐水冲洗，剪肾皮质成碎块，入上层筛网（孔径 250 nm） ，针芯轻压并冲洗肾组织入中层网(106 nm)、继续轻研并冲洗组织碎屑入下层网(75 nm)，收集此层组织悬液镜下观察为纯净肾小球（98%） 、即停止冲洗，移入离心管离心（800 rmin-1） 3 min，弃上清，加入 100 gL-1 V 型胶原酶 23

8、mL 混匀、置 37孵育箱消化 1520 min，至肾小球包曼囊剥离、细胞散出，用 100 gL-1 FCS+RPMI 1640 终止消化，离心（ 800 rmin-1）25 min，弃上清，将沉淀混匀加 GMC 培养液，入 37，50 mLL-1 CO2 孵育箱中培养. GMC 鉴定1用抗结蛋白和抗细胞角蛋白抗体进行间接免疫荧光染色，结果示：抗结蛋白为阳性，胞质中可清楚见中间微丝结构，抗细胞角蛋白和因子相关抗原为阴性，证实为 GMC. SKI 含药血清制备：Wistar 大鼠 8 只，随机分为 SKI 低(L)、中(M)、高(H)剂量组和正常组各 2 只；按 SKI 临床推荐用量(0.5 g

9、kg-1)的 2，4，8 倍作本实验的 L，M，H 剂量，分别为：3.5, 7.0 和 14.0 mLkg-1，鼠尾静脉注射给药,每日 1 次、共 7 d；正常组动物同时同法给生理盐水 7 mLkg-1；大鼠活动、进食良好. 第 7 日给药后 2 h，眼球采血,无菌分离血清，56水浴 30 min 并滤菌，置-20保存备用. 取第 3 代 GMC 植入 96 孔平底培养板(细胞密度5103/孔)，37, 50 mLL-1 CO2 培养箱中培养 24 h；弃上清、加无血清 RPMI 1640 同步 24 h；分组：SKI 低、中、高剂量组（5 gL-1, SKIL, 10 gL-1, SKIM,

10、 20 gL-1, SKIH)和培养基组（Baseline） ，SKI 低、中、高剂量含药血清组（SKILS, SKIMS, SKIHS）和血清组（Serum） ；分别于刺激培养 12, 24, 36, 48 和60 h 收集细胞上清；细胞增殖检测用 MTT 比色法2 、FN 检测用双抗体夹心 ELISA 法3 ；用 SPSS 软件进行重复测量资料的方差分析. 2 结果 2.1SKI 对体外培养 GMC 增殖的影响 Baseline 组 GMC 保持平稳增殖趋势,而 SKI 不同剂量对 GMC 的增殖均有明显抑制作用，随时间延长,药物剂量加大，抑制作用增强（P0.05） ，呈剂量依赖关系（Fi

11、g 1）. : Baseline; : SKIH; : SKIM; : SKIL. 图 1SKI 对体外培养 GMC 增殖的时间效应变化（略） Fig 1SKI on cultured glomerular mesangial cells（略） 2.2SKI 含药血清对体外培养 GMC 增殖的影响不同时间点，Serum组 GMC 增殖明显，与 Baseline 组比较有非常显著性差异（P0.01） ；12, 24 和 36 h, SKI 含药血清明显抑制 GMC 的增殖，呈剂量依赖性，以36 h 为抑制效应高峰；在 36, 48 h 其抑制作用逐渐减弱；在 60 h 抑制作用消失，并显示促增殖

12、作用(P0.05, Fig 2）. : Baseline; : Serum; : SKIHS; : SKIMS; : SKILS. 图 2 SKI 含药血清对体外培养 GMC 增殖的时间效应变化（略） Fig 2SKI serum on cultured glomerular mesangial cell（略） 2.3SKI 对体外培养 GMC 自分泌 FN 水平的影响 SKI3 剂量对 GMC 自分泌 FN 有明显抑制效应(P0.05, 0.01)、呈剂量依赖性，随刺激时间延长抑制效应呈减弱趋势（Fig 3）. : Baseline; : SKIH; : SKIM; : SKIL. 图 3S

13、KI 对体外培养 GMC 自分泌 FN 水平的时间效应变化（略） Fig 3Fibronectin secretion in cultured glomerular mesangial cells with SKI（略） 2.4SKI 含药血清对体外培养 GMC 自分泌 FN 水平的影响 SKI 含药血清对 GMC 自分泌 FN 水平有明显抑制作用（P0.01)、呈剂量依赖性；在12，24 和 36 h 对 FN 的抑制效应可能与 SKI 含药血清抑制 GMC 增殖有关，在 60 h，SKI 含药血清促进 GMC 增殖，但对 GMC 自分泌 FN 的抑制作用依然存在且有显著差异(P0.01)，

14、说明 SKI 体外直接加药与其含药血清对 GMC 增殖、自分泌 FN 效应存在差异，提示 SKI 含药血清可能出现促进FN 降解的新效应成分（Fig 4）. : Baseline; : Serum; : SKIHS; : SKIMS; : SKILS. 图 4SKI 含药血清对 GMC 自分泌 FN 抑制作用时间效应（略） Fig 4Fibronectin secretion in cultured glomerular mesangial cell with SKIserum（略） 3 讨论 SKI 由大黄、黄芪等制成的中药复方静脉制剂，可直接加药进行体外实验，亦应选用血清药理学方法，观察

15、SKI 经机体代谢后，其成分或代谢产物对 GMC 之效应，此更能反映或接近 SKI 在体内所产生的药理效应实际. 研究表明：大黄蒽醌、大黄酸蒽醌酮葡萄糖甙直接抑制 GMC 生长，大黄衍生物的血清亦明显抑制 GMC 的 DNA 和蛋白质合成，有利于减轻 GMC病理性增生，减缓肾组织硬化进程4 ；川芎嗪亦抑制 GMC 增殖5. 以上研究为观察 SKI 及其含药血清对 GMC 增殖的影响提供了可靠依据. 本实验初步显示：SKI 抑制体外培养 GMC 的增殖并呈剂量依赖性，效应从刺激 12 h 始、延续至 60 h，呈递增趋势；SKI 含药血清对 GMC 增殖的抑制效应与 SKI 血药浓度有量效依赖性

16、，效应强度随刺激时间延长呈递减趋势，提示 SKI 及其含药血清可明显减缓 GMC 增殖，但效应不同. FN 是一种始动因素，可能诱导胶原的形成、促进 GS6 ，FN 在病变早期主要来源于血浆，中、后期为肾小球局部合成，其中以 GMC 为主. 本实验显示：SKI 可明显抑制 GMC 自分泌 FN 的水平，呈现剂量、 时间 依赖性，说明 SKI 抑制了 ECM 生成或积聚的始动因素，阻止 ECM 堆积，防止 GS 发生. ECM 含有, , 型胶原和 FN、纤维连接蛋白、内动蛋白、硫酸肝素蛋白聚糖等成分，不含间质胶原（, 型胶原）. ECM 的堆积，一是合成增加、二是降解减少，当肾小球 ECM 的

17、合成与降解有利合成时，则出现 ECM 的堆积. SKI 含药血清在不同时间点对 GMC 自分泌FN 均有明显抑制作用，这一抑制作用可能与 SKI 内含大黄素、黄芪甲甙等有效成分有关，在 60 h，SKI 含药血清对 GMC 增殖无抑制作用，但对其自分泌 FN 的抑制作用依然存在，且 3 剂量组间有显著性差异（P0.05） ，与对照组亦有显著性差异(P0.01). 说明 SKI 经体内代谢，其含药血清可能出现提高 FN 降解酶活性的新物质，或产生降解 FN 的某种活性成分，有待今后研究证实. 【参考文献】 1 Yu LF, Chen XM, Li LS. Investigation of hum

18、an glomerular mesangial cell in culture J. Zhonghua Shenzangbing Zazhi （Chin J Nephrol）,1990;6（2）:70. 2 Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:Application to proliferation and cytotoxicity assay J. J Immu Methods,1983;65:55-64. 3Nahman NS, Leonhart KL, Cosio FG, Hebem CL

19、. Effects of high glucouse on cellular proliferation and fibronectin production by cultured human mesangial cells J. Kid Int, 1992;41:396-402. 4Jiang GW, Chen XM, Li LSH. Study of invitro effects of Rhubarb on rat mesangial cell growth J. Zhonghua Shenzangbing Zazhi （Chin J Nephrol）,1990;6（3）:133-13

20、6. 5 Sun L, Yi ZW, Yu PL. Effects of Tetramethylhyrazine of human fetal mesangial cells J. Zhongguo Zhongxiyi Jiehe Zazhi（Chin J Integ Trad West Med）, 1995;15（3）:134-135. 6 Zhang Y. Study of the relationship between fibronectin and sclerosis of renal glomeruli J. Zhonghua Binglixue Zazhi（Chin J Pathol）, 1987;16（1）:36-38.