微量注射甲基软海绵酸对大鼠海马神经元放电的影响.doc

1、微量注射甲基软海绵酸对大鼠海马神经元放电的影响【关键词】 注射 【摘要】 目的探寻新的建立老年痴呆模型的方法。方法大鼠海马背侧微量注射 0.4 mmol/L 甲基软海绵酸（Okadaic acid,OA)1 1，每两天 1 次，连续 3 次。海马背侧首次微量注射 20 d 后，测试各组大鼠空间学习记忆能力；行为学检测结束后，在注射对侧海马观察各组神经元自发放电。结果海马背侧微量注射 OA 大鼠空间学习记忆能力明显降低，海马神经元放电频率明显减少，放电形式发生改变。结论 OA 对海马影响明显，提示此法可建立老年痴呆模型。 【关键词】Alzheimer 病；甲基软海绵酸；自发放电；Morris 水

2、迷宫；动物模型 【Abstract】Objective In order to explore a new way of establishing Alzheimers animal model. MethodsOkadiac acid(0.4mmol/L1 l) was injected into the right dorsal hippocampus,once every two days for three times.The place navigation and spatial probe ability in rats were assessed by Morris water

3、 maze on day 20 after the first injection.After the spatial probe test,the spontaneous discharge was observed in the left hippocampus. ResultsBy injecting okadaic acid into the dorsal hippocampus,the spatial learning and memory ability in rats was significantly impaired by okadaic acid,the discharge

4、 frequency of hippocampus neurons was signifcianly reduced,and the format of the discharge was also changed.ConclusionOkadaic acid affected the hippocampus significantly.It suggests that this method can be used to establish the experimental model of AD. 【Key words】Alzheimers disease,okadaic acid, sp

5、ontaneous discharge, Morris water maze,animal model Alzheimer 病（AD）是常见的老年慢性退行性神经疾病，到目前为止，其确切病因和发病机制尚不清楚。临床上首先表现为近期记忆力降低，继而表现为持续性智能衰退，失语，判断推理能力丧失，以及运动功能障碍等。目前用于 AD 研究的模型较多，但均不理想。有文献报道，大鼠侧脑室微渗透泵慢性注射甲基软海绵酸（大田酸；Okadaic acid，OA）后，出现学习记忆障碍，在海马 CA1 区和齿状回见到双螺旋细丝（paired helical filament,PHF）和淀粉样蛋白前体（APP）阳性营养

6、不良性轴突等改变，并伴有细胞凋亡现象，认为 OA 毒性动物可能是一种较理想的 AD 模型， 。本文通过大鼠海马背侧埋管多次微量注射OA，观察大鼠条件反射及海马神经元自发放电，旨在探讨大鼠海马微量注射 OA 后的变化，以期能够找到一种理想的老年痴呆模型。 1 材料和方法 1.1 试剂和仪器 OA 粉剂（购自 Sigma 公司） ，临用前溶解于 10%二甲亚砜（DMSO）中，制成浓度为 0.4mmol/L 的溶液；DigBehv Morris 水迷宫（上海计量软件科技有限公司） ；脑立体定位仪、DYT- 1 型微电机操纵器（天津医疗器械研究所） ；微机、BL- 420E 生物机能系统（成都泰盟科技

7、有限公司） 。 1.2 动物及分组 Wistar 大鼠 20 只，雄性，35 月龄，体重 250300 g，购自贵阳医学院动物中心合格证号：SCXK(黔)2002- 0001 。随机分为 2 组：海马注射 OA 模型组和对照组，每组 10 只大鼠，自由进食、饮水，自然昼夜节律光照。 1.3 模型制作注射 OA 组大鼠选择右侧海马为注射靶区，经 10%水合氯醛（0.3 ml/100 g）腹腔麻醉后，固定大鼠于立体定位仪上，常规备皮，切开皮肤。参照大鼠脑立体定位图谱 ，经预实验确定进针点为：A 3.6 mm，R 2.4 mm，H 2.7 mm 处。用牙科钻钻开颅骨，暴露硬脑膜，针头刺破硬脑膜。将十

8、字套管上端连于定位针，插到海马上部，502 胶水涂于十字套管周围，牙托水和牙托粉混合成糊状涂于十字套管周围，干燥后，抽出定位针。用 1 l 微量注射器抽取 1 l OA 溶液,通过十字套管缓慢注入海马，1 min 内注完，留针 10 min，以使药品充分扩散。对照组用同样的方法注射等容积的 10%二甲亚砜。以后每隔两天注射 1 次，连续注射 3 次。每只大鼠每天肌肉注射青霉素预防感染，连续 5 d。水迷宫测试于首次注射后第 20 天开始，海马神经元自发放电于首次注射后第 27 天开始。 1.4 行为学观察 Morris 水迷宫由圆形水池及自动录像、记录系统两部分组成。水池直径 160 cm，水

9、池深 50 cm，水深 30 cm，水温(251)，水池内充放洁净自来水，水中加适量黑色素，以隐蔽站台。实验时将水池划分为、四个象限，见图 1。在水迷宫水池壁各象限中点处标明 4 个入水点，在第象限中放置一个直径 12 cm 的站台，没于水下 1 cm，以站台中心 6 cm 的区域为 E 区。实验时将大鼠面向池壁，分别从四个象限的入水点放入水池，自动录像系统记录大鼠找到平台的时间和游泳路径。实验共 7 天，即 6 d 进行定向航行实验（place navigation test）：将大鼠从入水点放入水池中，记录 60 s 内大鼠从入水到爬上平台所需时间即逃避潜伏期。每只大鼠每天训练 4 次，即

10、从四个象限不同入水点入水进行训练各 1 次。于第 7 天进行 图 1Morris 水迷宫训练示意图 1.5 海马神经元单位放电术后第 27 天，大鼠经腹腔注射 20%乌拉坦（1 g/kg）麻醉后，固定在立体定位仪上，参照大鼠脑立体定位图谱3 ，在 A 4.05.0 mm，L 5.05.2 mm，H 2.77 mm，用 DYT- 1 型微电机操纵器，将玻璃微电极插入左侧海马内，引导海马 CA1、CA3 区神经元自发放电。微电极内充灌 0.5 mol/L 醋酸钠和 2%滂胺天蓝溶液，电极尖端直径 12 m,直流电阻为 215 M。微电极引导信号经放大器放大，监听器监听,电脑 BL- 420 生物机

11、能系统记录并分析，进行数据处理。实验结束电泳滂胺天蓝，通电 1015 min 以标记记录部位，然后经主动脉灌注，取脑，置于 10%福尔马林溶液中固定，1 周后，作连续冰冻切片，进行组织学鉴定，以确定记录部位，定位不准确的结果舍去。 1.6 统计学处理实验数据以 x s 表示,采用 t 检验和 2 检验。 2 结果 2.1OA 对大鼠空间学习记忆的影响大鼠海马背侧首次微量注射 20 d后，用 Morris 水迷宫法检测两组大鼠的定向航行、空间探索能力。定向航行试验结果见表 1。在 6 d 的训练中，两组的逃避潜伏期均不断缩短，但对照组第 6 天比第 1 天缩短了 79.68%，而模型组比第 1

12、天仅缩短了60.25%,两者相比，差异性显著（P0.05） ；且从第 3 天开始，大鼠逃避潜伏期对照组和模型组相比差异性显著（P0.05） 。 表 1 对照组和模型组大鼠空间定向航行能力分组n逃避潜伏期（略）注：与对照组相比，P0. 05。 大鼠空间探索实验结果见表 2。在 6 d 训练结束后，于第 7 天撤去站台，以大鼠穿越站台次数及大鼠在第象限游泳距离占总游泳距离百分比作为衡量记忆好坏指标，模型组穿越站台次数比对照组少 50. 45%，两组比较差异性显著（P0. 05） ；模型组大鼠在第象限游泳距离占总游泳距离百分比比正常对照组少 22.01%，两组比较有显著性差异（P0. 05） 。大鼠

13、游泳方式典型轨迹见图 2，大鼠空间搜索过程的游泳轨迹在正常对照组多以第象限为主，即绕站台游泳（图 2B）占 30%，穿梭样寻找（图 2C）占 45%，作环池游泳（图 2A）占 25%；而模型组在第象限绕站台游泳仅为总距离的 20%，穿梭样寻找占 25%，而以环池游泳为主要方式者占 55%。经 2 检验显示各种搜寻方式的构成比在两组中有明显差异（P0. 01） 。 表 2 对照组和模型组大鼠空间探索能力分组n穿越站台次数（略）注：与对照组相比，P0. 05 2.2OA 对大鼠海马神经元单位放电的影响本次实验共记录到 141 个海马神经元自发放电，正常对照组 76 个，模型组 65 个。采用每分钟

14、记录到的细胞放电数（即频率）作统计学处理，两组比较有显著性差异（P0. 05）,见表 3。根据放电间隔时间不同，海马神经元自发放电可分为规则型（放电间隔时间基本相等）和不规则型两大类。每一型又分为单放（单个放电）亚型和单放+簇放（簇状放电）亚型，见图 3。从表 3 可以看出，模型组海马神经元放电频率比对照组明显减少，两组相比差异性显著（P0. 05） ；对照组规则型放电占 20.05%，模型组仅 9. 23%，而模型组不规则型放电占 90. 84%，对照组占 78. 95%，说明放电形式也发生了变化。 A 大鼠环池游泳 B 大鼠绕站台游泳 C大鼠穿梭游泳 图 2 大鼠典型游泳轨迹图 表 3 对

15、照组和模型组海马神经元自发放电分组放电神经元（略）注：与对照组相比，P0. 05。 图 3 大鼠海马神经元不规则放电 3 讨论 目前 AD 所引起的老年健康问题已受到全世界广泛关注，有关其病理、病因学研究已成为热点。AD 患者的主要神经系统病理改变为：神经细胞之间形成大量老年斑（senile plaques,SP）和神经细胞内出现神经元纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTs)。老年斑的主要成分是由 APP裂解成的 - 淀粉样蛋白（- amyloid peptide,A） ；神经纤维缠结由许多互相缠绕的细丝形成的成对螺旋状结构组成，其主要成分是过度磷酸化 tau 蛋白

16、。这些病理改变主要发生在海马和新皮层 。海马与机体的学习、记忆密切相关，海马不同区域的功能不尽相同，其中CA1 和 CA3 区在学习、记忆中担负重要作用 。目前用于 AD 研究的动物模型有衰老动物模型、损毁模型、自身免疫性痴呆模型、转基因动物模型等，但都缺乏 AD 脑内特征性病理变化 。在 AD 患者脑中，异常过度磷酸化 tau 蛋白含量显著增高，它聚集成双螺旋丝形状，丧失了促进微管组装的生物活性，导致细胞骨架的结构异常和神经细胞死亡， 。OA 是一种蛋白磷酸酯酶抑制剂，能抑制丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酯酶 1A 和 2A 的活性。正常胞内磷酸酯酶和磷酸激酶处在动态平衡之中，OA 通过抑制磷酸酯酶

17、使激酶处于相对高活性状态，从而能使tau 蛋白高度磷酸化并形成 NFTs 样改变，还可使海马神经元细胞发生凋亡 。本实验采用海马背侧多次微量注射 OA 建立拟 AD 模型。通过水迷宫实验测试，发现模型组大鼠逃避潜伏期与正常对照组大鼠比较差异显著（P0.05） ，说明模型组大鼠空间方位记忆能力明显降低。在撤去平台后，模型组大鼠穿越站台次数及在第象限游泳距离占总游泳距离百分比较正常对照组明显减少，各种空间搜寻方式的构成比在两组有明显差异，表明模型组大鼠学习行为模式也发生了改变。脑电活动是直接反应大脑细胞功能状态的较好指标，只要神经细胞的功能稍有改变，其电活动即随之改变。我们通过观察海马 CA1、

18、CA3 区神经元自发放电发现，模型组海马放电频率远远较正常组低,两组比较差异显著（P0.05） ，且放电形式也发生了改变。结合近期的报道，海马注射OA 可使海马组织出现 SP、NFTs 等 AD 样特征性病理变化 。我们认为海马背侧埋管多次微量注射 OA 建立 AD 模型，是研究 AD 病因、发病机制的一种较理想模型，也可以为研究抗 AD 药物疗效提供载体。 参考文献 1.Arendt T.Holzer M,Fruth R,et al.Paired helical filament- like phosphorylation of tau,deposition of /A4- amyloid

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