巫山淫羊藿在不同生长季节中两种黄酮类成分的反相高效液相色谱分析.doc

1、巫山淫羊藿在不同生长季节中两种黄酮类成分的反相高效液相色谱分析作者：贾敏鸽， 孙文基 ， 周金云， 朱朝德， 胥道宝【关键词】 巫山淫羊藿；,黄酮类成分；,柔藿苷；,淫羊藿苷；,生长季节；,高效液相色谱法,摘要：目的对中国药典淫羊藿药材的收载品种巫山淫羊藿中2 种黄酮类成分柔藿苷（rouhuoside）和淫羊藿苷（icariin）进行测定，比较这两种成分在不同月份的含量变化。方法采用反相高效液相色谱（RP HPLC）法，以 beckmancoulter TM C18 柱（带预柱）为色谱柱，流动相为乙腈水（2575） ，流速 1.0 mlmin1，检测波长为 270 nm。结果柔藿苷在 0.19

2、6 42 1.964 2 g 范围内呈良好的线性关系，淫羊藿苷在 0.193 35 1.933 5 g 范围内呈良好的线性关系。巫山淫羊藿中淫羊藿苷除 5 月份外，其余月份的含量都低于 0.5，而柔藿苷的含量平均在 1.710。结论 巫山淫羊藿在其生长的任何月份都是柔藿苷含量远大于淫羊藿苷含量，柔藿苷是巫山淫羊藿中的主要成分。关键词：巫山淫羊藿； 黄酮类成分； 柔藿苷； 淫羊藿苷； 生长季节； 高效液相色谱法 Determination of 2 Flavonoids in Epimedium wushanense in Different Growing Seasons by HPLC) A

3、bstract：Objective To determine the content of rouhuoside and icariin in Epimedium wushanense，and compare the content variety of these 2 compounds in different growing seasons. MethodsSamples were dealt with by HPLC with beckmancoulter TMC18 analytical column. The mobile phase was consisted of aceton

4、itrile-water (25: 75). The flow rate was 1.0 mlmin1. The UV detection was set at 270 nm. ResultsThe linear response range from 0.196 42 1.964 2g of rouhuoside (r=0.999 12,n=10); 0.193 35 1.933 5 g of icariin (r=0.999 00,n=10).In the whole growing seasons of Epimedium wushanense, the content of icari

5、in is less than 0.5% except for in May, while the content of rouhuoside is more than 1.710%. ConclusionAs far as rouhuoside and icariin to be concerned, the content of rouhuoside is much higher than that of icariin in each month of the growing seasons of Epimedium wushanense, and rouhuoside is the m

6、ain component in Epimedium wushanense. Key words：Epimedium wushanense; Flavonoids; Rouhuoside; Icariin; Growing seasons; HPLC 巫山淫羊藿为小檗科淫羊藿属植物 Epimedium wushanense T.S.Ying的地上部分，是 1995 年版中国药典增收的淫羊藿品种，功能补肾壮阳，强筋骨，祛风湿，用于治疗阳痿遗精、风湿痹痛等症。巫山淫羊藿中淫羊藿苷（icariin）及总黄酮类成分的含量测定，文献多有报道，但有关柔藿苷尤其是柔藿苷（rouhuoside）与淫羊藿苷在不

7、同月份的含量比较尚未见报道。本文对这二种黄酮类成分进行了系统的研究。现将结果报道如下。1 仪器与材料1.1 仪器美国 BECKMAN 公司高效液相色谱仪，包括 125 型泵，168 型 PDA 检测器，32Karat 色谱工作站；HAMILTON 微量进样器（HAMILTON 公司） ；微孔滤膜 13 mm，4.5 m（天津市色谱科学技术公司） ；YCQ300 型超声波清洗器（上海凯波超声设备有限公司） 。1.2 对照品柔藿苷和淫羊藿苷对照品均为作者从巫山淫羊藿中提取分离，并经光谱分析鉴定，HPLC 面积归一化法显示其纯度分别为98.92%，99.07%。1.3 药材样品由陕西省安康地区药品检

8、验所中药室鉴定并提供。1.4 试剂 所用试剂均为分析纯。2 方法和结果2.1 色谱条件 色谱柱：BECKMAN COULTER TM C18 柱（5m4.5 mm250 mm） ，预柱（4.6 mm45 mm） ；流动相：乙腈水（2575） ；柱温：室温；检测波长：270 nm；流速：1.0 mlmin1；进样量：20l。2.2 色谱系统适用性实验 理论塔板数以柔藿苷计为 3 567，以淫羊藿苷计为 3 708；柔藿苷 tR=21.13 min；淫羊藿苷 tR=24.767 min；柔藿苷和淫羊藿苷的分离度为 2.188。2.3 检测波长的选择柔藿苷和淫羊藿苷结构相似，在流动相中用二极管阵列检

9、测器测得紫外光谱最大吸收均在 270 nm 处，见图 1。故选择 270 nm 为吸收波长。2.4 流动相的选择 比较了 4 种溶剂系统：甲醇水；甲醇水冰醋酸；乙腈水；乙腈水 36醋酸。结果只有乙腈水（2575）分离效果最为理想且峰形较好，故选择乙腈水（2575）为流动相。色谱图见图 23。1.柔藿苷光谱图 2. 淫羊藿苷光谱图图 1 柔藿苷和淫羊藿苷的紫外光谱图（略）图 2 对照品的 HPLC 图谱（略）图 3 样品 5的 HPLC 图谱（略）2.5 线性关系考察精密称取柔藿苷对照品 9.82 mg，淫羊藿苷对照品 9.67 mg，分别用甲醇溶解并定容于 20 ml 量瓶中，各取0.1，0.

10、2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 ml 于 5 ml 量瓶中混合定容，取 20l 混合液进样。以峰面积为纵坐标，对照品进样量为横坐标，绘制标准曲线，得其回归方程。柔藿苷：Y 4.623 105 - 9.736 102 X，r=0.999 12；淫羊藿苷：Y 7.161 105 - 8.784 103 X，r=0.999 00。表明柔藿苷在 0.196 42 1.964 2 g,淫羊藿苷在 0.193 35 1.933 5 g 与峰面积呈良好线性关系。2.6 重现性实验取同一样品溶液 1 份，连续进样 6 次，20l/次，分别测定其吸收峰面积。结果柔藿苷峰面积

11、RSD2.83（n=6） ，淫羊藿苷峰面积 RSD4.17（n=6） 。2.7 精密度实验 取线性范围内的同一对照品溶液，每隔 1 h 进样 20l，测定 5 次/d，连续测定 3 d，记录峰面积，考察日内、日间精密度，测定结果柔藿苷、淫羊藿苷的日内精密度（ s）(n = 5) 分别为：5.307 105 5.978 103, RSD = 1.126%；8.265 105 2.113 104，RSD = 2.557%；柔藿苷、淫羊藿苷的日间精密度（ s） （n = 3）分别为：5.072 105 2.091 104, RSD = 4.123%；8.242 105 2.061 104，RSD =

12、 2.500%。2.8 加样回收率实验 在巫山淫羊藿的生药中定量加入对照品溶液，自然挥干后，按上述供试品溶液制备样品溶液，分别测得柔藿苷、淫羊藿苷回收率。结果见表 1。表 1 加样回收率实验结果（略）2.9 供试品溶液的制备及测定精密称取样品粉末（约 0.13 g，经60干燥 3h，过 40 目筛） ，置于 50 ml 具塞三角瓶中，加入 30 ml 70%乙醇，称重，超声提取 1 h，称重并补足减失重量，过滤，弃去初滤液，取续滤液用微孔滤膜（4.5m）过滤，作为供试品溶液，吸取 20l 注入高效液相色谱仪。测定结果见表 2。以柔藿苷和淫羊藿苷各自的含量对月份作图。见图 4。图 4 柔藿苷和淫

13、羊藿苷的含量图（略）表 2 巫山淫羊藿叶在不同生长季节的柔藿苷和淫羊藿苷含量测定结果（略）3 讨论本文采用 RP HPLC 技术对巫山淫羊藿一年内每一月份的柔藿苷和淫羊藿苷的含量进行了比较研究，结果表明在其生长期内始终是柔藿苷含量远高于淫羊藿苷，平均为淫羊藿苷的 4.65 倍。从图 4 可见，巫山淫羊藿中柔藿苷以 8 月和 9 月份采收含量最高，淫羊藿苷以 5 月份采收含量最高，二者不具相关性。本实验中曾试用了多种溶剂系统作为流动相，包括 2000 版药典淫羊藿苷含量测定项中规定的乙腈水（3070） 。发现在以乙腈水（3070）为流动相时，淫羊藿苷与其邻近峰的分离度较好，可以完全分开，但是柔藿

14、苷却很难与其后面紧跟的位于淫羊藿苷之前的峰分开。如果以乙腈水（2575）为流动相时，不仅淫羊藿苷与其邻近峰的分离度较好，可以完全分开，并且柔藿苷也可以与其后面紧跟的位于淫羊藿苷之前的峰很好地分开，见图 5。因而实验中选择以乙腈水（2575）为流动相。图 5 选择流动相（略）中国药典 （2000 版）规定淫羊藿中淫羊藿苷的含量不得低于0.500。本文测得巫山淫羊藿中淫羊藿苷除 5 月份外，其余月份的含量都低于 0.5，而柔藿苷的含量平均在 1.710，另外，RP HPLC 面积归一化法，也显示柔藿苷为主要成分。由此看来，巫山淫羊藿中的主要成分并不是淫羊藿苷。 参考文献：1 国家药典委员会.中国药典,部S.北京：人民卫生出版社，2000：267.(中国医学科学院 中国协和医科大学药物研究所，北京 100050；西北大学生物医药重点实验室，陕西 西安 710069； 陕西省安康地区药品检验所，陕西 安康 725000)