盐酸丁咯地尔预处理对大鼠坐骨神经损害后神经元血管内皮生长因子的影响.doc

1、盐酸丁咯地尔预处理对大鼠坐骨神经损害后神经元血管内皮生长因子的影响作者：苏建华，章莉萍，陈玉芳，唐金荣，肖杭，包德诚 【关键词】 盐酸 摘要 :目的 观察盐酸丁咯地尔对坐骨神经损害后神经元血管内皮生长因子（VEGF）的影响。 方法 SD 大鼠随机分为正常组、模型组、预处理组（盐酸丁咯地尔组） ，预处理 14 天后制作周围神经损害动物模型，分别在造模后 6h、12h、24h、48h、72h、96h、7 天各组提取 L15 背根神经节，免疫组化观察 VEGF 阳性细胞表达数，考察盐酸丁咯地尔预处理对坐骨神经损害后神经元 VEGF 的影响。 结果 正常组 VEGF 阳性细胞见少量表达;模型组在造模

2、48h 表达到高峰，持续至 72h;而丁咯地尔造模24h 即有明显表达，48h72h 表达到高峰，持续至 7 天时与模型组比较仍有显著性差异（P0.05） 。 结论 盐酸丁咯地尔可通过上调 VEGF来保护周围神经损害后神经元。 关键词 :盐酸丁咯地尔;预处理;坐骨神经损害;神经元;血管内皮生长因子 周围神经损伤后可引起相应节段神经元的死亡，严重地影响了周围神经的再生及其功能的恢复。 因此，如何保护神经损伤后神经元、减少其损害或死亡，使其能最大限度地恢复功能，已引起人们的广泛关注。本课题前部分实验已证实了盐酸丁咯地尔对周围神经损害后神经元有确切的保护作用1 ，本实验观察盐酸丁咯地尔预处理后对坐骨

3、神经损害后神经元的血管内皮生长因子（VEGF）的影响，以探讨其保护作用的可能机制。 1 材料和方法 1.1 材料和分组 盐酸丁咯地尔，南京金陵药业有限公司（批号:021104）;免疫组化试剂盒（即用型非生物素 pv-6001.6002 试剂盒） ，北京中杉金桥生物技术有限公司;DAB 显色试剂盒，北京中杉金桥生物技术有限公司。其他试剂为国产分析纯。常规神经分离设备 1 套。SD 大鼠 84只，SPF 级，体重 180220g（由无锡市江南实验动物有限公司提供） 。 禁食 12h，按体重随机分层分组，分为正常对照组、模型组、预处理组（盐酸丁咯地尔组） ，每组 28 只，雌雄各半。 1.2 方法

4、1.2.1 预处理 正常组不给药，模型组腹腔注射等体积生理盐水，预处理组予盐酸丁咯地尔 40mgkg -1 d -1 。腹腔注射，共 14 天。常规喂养。 1.2.2 大鼠周围神经损害动物模型的建立 参照 Patro 等2 方法制作周围神经损害动物模型:大鼠用 3%戊巴比妥 10ml.kg 麻醉，仰卧固定于鼠板上，于右后肢腹股沟处切开皮肤约 1cm，钝性分离肌肉组织，暴露坐骨神经，正常组坐骨神经暴露后即关闭切口，其余各组大鼠用压力为体重一半的重量挤压坐骨神经，持续 30s，然后松开，关闭切口。常规注射抗生素预防感染。 1.2.3 背根神经节的分离 分别在造模后6h、12h、24h、48h、72

5、h、96h、7 天，各组各处死实验大鼠 4 只。参照文献3方法，处死大鼠立即切开背部皮肤，沿脊柱两侧剪断与之相连的肋骨，取出胸腰段脊柱，由脊柱正中剖开成两半，从剖开的椎管内侧小心分离 L 15 背根神经节，放入 10%甲醛溶液中，以备 VEGF 免疫组织化学染色检查。 1.2.4 神经节细胞 VEGF 免疫组织化学染色 载玻片采用 APES 涂片;切片常规脱蜡至水;3%H 2 O 2 去离子水孵育 510min，阻断内源性过氧化酶;对抗原进行热修复;滴加一抗（VEGF 鼠抗人单克隆抗体，即用型） ，4冰箱过夜，PBS 冲洗，2min3 次;滴加山羊抗小鼠 IgG 抗体-HRP 多聚体，室温孵育

6、 2030min，PBS 冲洗，2min3 次;DAB 显色;自来水冲洗;苏木精复染，脱水透明，封片。显微镜（400 倍）观察胞质呈褐黄色颗粒为阳性细胞。 1.2.5 图像分析 各组各时间点随机抽取 2 张 VEGF 免疫组织化学染色片，光镜（400 倍）观察各组各时间点阳性表达细胞数（每张切片任取 5 个视野计数免疫组化染色阳性表达细胞数，取其平均值）并加以比较。 1.3 统计学处理 实验结果以xs 表示，用 SAS6.12 统计软件包进行方差分析，0.05 为统计学有显著性差异。 2 结果 正常组背根神经元细胞仅有少量 VEGF 表达。模型组在造模 48h 后有较多表达，72h 达高峰，9

7、6h 之后降至正常组水平。丁咯地尔预处理组在造模 24h 后即有大量表达，与模型组比较有显著性差异（0.05） ，4872h 表达达到高峰，与同期模型组比较有显著性差异（0.01） ，7 天时丁咯地尔预处理组仍有较高表达，与模型组比较有显著性差异（0.05） 。见表 1。 表 1 盐酸丁咯地尔预处理对大鼠周围神经损害模型背根神经元VEGF 表达的影响（略） 与正常组比较:*P0.05，*P0.01;与模型组比较:#P0.05，#P0.01 3 讨论 VEGF 是促进血管内皮细胞分裂和增殖的有丝分裂源，通过激活内皮细胞上的磷脂酶 C 短暂地诱导 Ca 2+ 离子释放，对内皮细胞的生长起刺激和趋化

8、作用，在体内可诱导血管生成4 。VEGF 不但有助于神经元免受低氧和糖缺失的损害，而且能刺激轴突生长和改善背根神经元的存活，VEGF 可直接发挥神经保护作用5-6 。 本实验以免疫组化染色方法，观察各组坐骨神经损害后各时间点神经节细胞 VEGF 表达，结果:模型组在造模 48h 后有较多表达，72h 达高峰，96h 之后降至正常组水平。而丁咯地尔预处理组在造模 24h 后即有大量表达，与模型组比较有显著性差异（0.05） ，4872h 表达达到高峰，与同期模型组比较有显著性差异（0.01） ，7 天时丁咯地尔预处理组仍有较高表达，与模型组比较有显著性差异（0.05） 。从本实验结果可以看出:丁

9、咯地尔预处理组 VEGF 表达时间较模型组明显提前，且表达时间延长，表达峰值增高，说明盐酸丁咯地尔可通过上调 VEGF 来保护周围神经损害后神经元。 参考文献 : 1 苏建华，徐厚明，唐金荣，等.盐酸丁咯地尔对周围神经损害的保护作用J.中国新药杂志，2004，13（12）:1322-1324. 2 Patro IK，Chattopadhyay M，Patro N.Flunarizine enhances functional recovery following sciatic nerve crush lesion in ratsJ.Neurosci Lett，1999，26（3）:97-10

10、0. 3 谭振军，魏劲波，李之望，等.催产素对大鼠背根神经节分离细胞 GABA 激活电流的调制作用J.生理学报，2000，52（5）:381-384. 4 Maeda K，Chung YS，Ogawa Y，et al.Prognostic value of vascular en-dothelial growth factor expression in gastric carcinoma J.Cancer，1996，77（5）:858-863. 5 Jin KL，Mao XO，Greenberg DA.Vascular endothelial growth factor:direct neu

11、roprotective effect in vitro ischemia J.PNAS，2000，97（18）:10242-10247. 6 Sondell M，Lundborg G，Kanje M.Vascular endothelial growth factor has neurotrophic activity and stimulates axonal outgrowth，enhancing cell survival and Schwann cell proliferation in the peripheral nervous systemJ.J Neurosic，1999，19（14）:5731-5740.