中药复苏饮对严重脓毒症患者外周血单核细胞TLR2、TLR4基因表达的影响.doc

1、中药复苏饮对严重脓毒症患者外周血单核细胞 TLR2、TLR4 基因表达的影响【摘要】 观察中药复苏饮对严重脓毒症患者外周血单核细胞TLR2、TLR4 基因表达的影响。 【方法】将例患者随机分为复苏饮组（治疗组）和安慰剂组（对照组）各例，两组均采用西医常规监护治疗，治疗组配合使用中药复苏饮（由工人牛黄、西洋参、黄芪、生大黄、生石膏、麦冬、丹参、赤芍、猴枣等组成） ，而对照组则加用安慰剂。另选取名健康体检者作为正常组。采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR)法测定治疗前及治疗第、第天外周血单核细胞 TLR2、TLR4 mRNA表达的变化。 【结果】治疗前两组患者单核细胞 TLR2、TLR4 mRN

2、A表达显著低于正常组（.)。对照组于治疗第天 TLR2、TLR4 mRNA表达开始明显升高（.1);治疗组于治疗第天 TLR2、TLR4 mRNA表达即明显回升，且治疗后各个观察点的基因表达明显高于对照组（.);但两组的、 mRNA 表达均未达到正常组水平（.或.1） 。 【结论】中药复苏饮可明显上调外周血单核细胞 TLR4、TLR2 mRNA 的表达，降低严重脓毒症患者的病死率。【关键词】 脓毒症 中药疗法 复苏饮 治疗应用 Toll 样受体 脓毒症是一种全身感染性疾病。以往研究认为，多种病原微生物的细胞壁成分如革兰阴性菌的内毒素（LPS） ，革兰阳性菌的肽聚糖（PGN)和脂磷壁酸（LTA)

3、等均可通过与细胞表面的蛋白质受体 CD14结合，诱导全身炎症反应，从而导致脓毒症休克甚至多脏器功能衰竭综合征（） 。然而，由于 CD14本身是一种膜锚蛋白（缺乏跨膜区和胞内区） ，不能直接向细胞内传导信号，新近研究发现，Toll 样受体（Tolllike receptors,TLRs)可能是跨膜信号转导的门户蛋白 。 目前，已克隆的人类的 TLRs成员有个（即 TLR110)，其中TLR2和 TLR4的作用尤为显著。TLRs 如同天然免疫的眼睛，监视与识别各种不同的病原特异性分子模式（pathogenspecific molecular patterns,PAMPs)，激活B 信号通路，启动一

4、系列免疫炎症反应，最终达到清除入侵的病原微生物的目的，在天然免疫中发挥重要的抗感染免疫功能。因此，以 TLRs信号受体为靶向，可能为脓毒症的防治带来新的希望。本文通过观察中药复苏饮对严重脓毒症患者外周血单核细胞TLR2、TLR4 基因表达的影响，从受体角度初步探讨中药在抗感染免疫中的作用。现将结果报道如下。 1 资料与方法 1.1 临床资料 1.1.1 病例选择及分组 所选病例为年月至年月广州中医药大学第一附属医院 ICU收治的严重脓毒症的患者，确诊h 内被纳入研究。但需除外以下情况：年龄小于岁;妊娠及哺乳期妇女;前个月内接受化疗者;目前或前个月内接受皮质激素或其他免疫抑制剂、免疫调节剂治疗者

5、;有免疫系统疾病者;人类免疫缺陷病毒（HIV）阳性者;终末期肝功能或肾功能衰竭者;入院4h 内死亡者。符合纳入标准的患者共例，在取得患者或家属知情同意后被纳入研究，其中例因经济原因自动出院而被剔除，最终入选患者共例。 入选患者依据随机数字表法分为西医常规治疗加复苏饮组（治疗组）和西医常规治疗加安慰剂组（对照组）各例。治疗组男例，女例;年龄最小岁，最大岁，平均（.4.8）岁;对照组男例，女例;年龄最小岁，最大岁，平均（.）岁;APACHE 评分：治疗组为（.）分，对照组为（.）分。同期在健康体检者中随机抽取名自愿者作为正常对照组（正常组） ，其中男例，女例;年龄最小岁，最大岁，平均（.）岁。组在

6、年龄、性别方面均无显著性差异（.)，且治疗组和对照组的 APACHE 评分亦无显著性差异（.),具有可比性。 1. 诊断标准 按照年国际脓毒症定义会议提出的脓毒症及严重脓毒症的诊断标准 。 1.2 治疗方法 所有入选患者均给予重症监护、抗炎、营养支持、维持血流动力学稳定、呼吸机辅助呼吸等西医常规治疗。治疗组在西医常规治疗基础上加用中药复苏饮（广州中医药大学第一附属医院制剂室提供，由人工牛黄、西洋参、黄芪、生大黄、生石膏、麦冬、丹参、赤芍、猴枣等组成，诸药研末分装胶囊，0.4 g/粒） ，品服或凉开水化开后鼻饲，每日 3次。均给对照组在西医常规治疗基础上加用安慰剂（广州中医药大学第一附属医院制剂

7、室提供，由淀粉色素制成，大小、颜色和外包装与复苏饮完全一致） ，用法同复苏饮。两组均以治疗天为个疗程，以天计算患者总病死率。 1.3 实验方法 所有患者被纳入研究时（治疗前） 、治疗第天、第天各取外周静脉血mL 用于单核细胞 TLR2、TLR4 mRNA表达的检测。所有病例在被纳入研究期间内留取血液、痰液、尿液等标本用于细菌学检查。 1.3.1 单核细胞的分离 患者于被纳入研究时（治疗前） 、治疗第天、第天分别取肝素抗凝静脉血mL，与等量 Hanks液充分混匀，用淋巴细胞分离液密度梯度离心法收集单个核细胞，然后用RPMT1640( 美国 Gibco公司）重悬细胞，置塑料培养瓶中，于，体积分数为

8、CO2 孵箱中温育h，所得贴壁细胞即为单核细胞，经苔盼蓝染色证实活细胞超过，Giemsa 染色证实其纯度大于。 1.3.2 TLR2、TLR4 mRNA 的检测 按照 RNA提取试剂盒（大连宝生物有限公司）说明书抽提单核细胞总 RNA。用紫外分光光度仪（UV1206, 澳大利亚 SHIUADIV公司）测量其纯度和含量，RNA 经电泳证实s 亚基为s 亚基的两倍，且/1.8。取 RNA样本g，采用逆转录-聚合酶链反应（RTPCR) 检测 TLR2、TLR4 mRNA 的表达，Bactin 的扩增作为内参照用，引物由华南理工大学科学与生物工程学院设计、上海博亚生物工程有限公司合成，见表。扩增产物取

9、每个反表 1 PCR引物序列组别合计感染来源 肺部腹腔内泌尿道其他病原菌培养结果单纯 G-单纯 G+混合阴性 治疗组（）对照组（）统计方法：单因素方差分析(Oneway ANOVA);：.，：.1,与治疗前比较(vs preT in the same group);:.,:.1,与对照组同期比较(vs group B);:.,:.1，与正常组比较(vs group C) 应体系L，于的琼脂糖凝胶中电泳，电泳结果在凝胶成像分析系统中分析泳带的平均密度面积值，用此值表示相应基因的表达强度。1.4 统计学处理 采用 SPSS 11.5统计软件进行数据的统计分析。 2 结果 2.1 两组患者的感染来源

10、及病原菌培养 结果见表。 2.2 两组d 病死率的比较 治疗组患者死亡例，存活例，病死率为;对照组患者死亡例，存活例，病死率为。两组比较，治疗组的病死率明显低于对照组（.)。 2.2 两组患者外周血单核细胞 TLR2、TLR4 mRNA 表达的比较 表结果显示，治疗前（被纳入观察时）两组患者单核细胞TLR2、TLR4 mRNA表达显著低于正常组（.1),而两组患者间无显著性差异（.)。治疗第天治疗组 TLR2、TLR4 mRNA表达明显回升，与治疗前比较有显著性差异（.);对照组 TLR2、TLR4 mRNA表达有恢复趋势，但变化不明显（.);两组比较，差异有显著性意义（.） 。治疗第天治疗组

11、 TLR2、TLR4 mRNA表达继续回升，但仍低于正常组水平（.);对照组 TLR2、TLR4 mRNA表达明显回升，与治疗前比较，差异有显著性意义（.1)，但上升水平不及治疗组（.)。 3 讨论 Toll样受体（Tolllike receptors,TLRs)是一种模式识别受体，在先天免疫中发挥主导作用。天然免疫的细胞，如单核细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、自然杀伤细胞（细胞）等，都不同程度地表达 TLRs。 病原体入侵时，TLRs 被相应的病原体相关分子模式（pathogenspecific molecular patterns,PAMPs)所激活，除了通过刺激天然免疫细胞

12、分泌大量的细胞因子、趋化因子诱导炎症反应外，还可直接增强天然免疫系统对病原微生物的清除能力。一方面，TLRs 增强吞噬细胞的吞噬能力，如 TLRs激活后中性粒细胞、巨噬细胞的吞噬能力明显增强- ，相反的抑制 TLRs信号通路，吞噬功能降低 。体内外观察结果显示，在 TLR2或 TLR4的基因上即使出现个碱基的突变，都会导致宿主对革兰阳性菌或革兰阴性菌的反应能力严重丧失- 。因此，TLRs 作为识别细菌共有成分的“模式“识别受体，在脓毒症的发生与发展中可能居核心地位。 本研究结果显示，严重脓毒症患者 TLR4、TLR2 mRNA表达明显低于正常水平，其结果可能使机体陷入无变应性（anergic)

13、状态，无法及时清除或杀灭病原菌，这种状态类似于中医学所说的“正虚邪盛“。现有的证据表明，许多中药可通过多种途径或环节提高机体抗感染免疫力，如扶正中药可增强网状内皮系统（）的功能，加速体内多种致病异物（包括内毒素）的清除，以保持机体内环境的相对恒定;清解药能增强单核-吞噬细胞系统（）及 T细胞功能，同时使体液免疫系统抗体增强，从而增强机体清除病毒和外毒素的能力，并能增强肾上腺皮质功能，对于非特异性炎症呈现抗炎作用 ，但以 TLR为靶点开展中药抗感染作用的研究目前尚处于起步阶段。 中药复苏饮主要由人工牛黄、西洋参、黄芪、生大黄、生石膏、麦冬、丹参、赤芍、猴枣等组成，具有益气养阴、清热解毒、凉血活血

14、、通里攻下之功。实验结果证实，治疗组（即复苏饮组）单核细胞TLR4、TLR2 mRNA表达回升速度较快，与此相对应，该组的病死率亦较对照组（安慰剂组）明显降低，这可能与中药通过调节 TLR活性和表达水平而增强了机体的抗感染能力有关，至于二者之间是通过怎样的途径和环节发挥对免疫系统的调控作用，尚需要进一步的实验研究证实。 【参考文献】 1Aderem A,Ulevitch R JToll2 like receptors in the induction of the innate immune response Nature,2000,406(6797):782 2Hayashi F,Means

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