中药安迪粉针剂对小鼠巨噬细胞cAMP含量的影响.doc

1、中药安迪粉针剂对小鼠巨噬细胞 cAMP 含量的影响作者：王四旺，刘玉凤，孙纪元，谢艳华，梁军，闫露，缪珊 【关键词】 中药 【Abstract】 AIM: To observe the effects of traditional Chinese medicine Andi on cAMP in murine peritoneal macrophages (M). METHODS: cAMP concentration in macrophages of mice abdominal cavity was determined by using cell culture and competi

2、tive protein conjunction analysis. RESULTS: cAMP level had some regular changes. Within 3 min following ip. Venenum Bufonis (VB), the cAMP concentration rose rapidly and reached the peak value at 6 min, then declined gradually and recovered to the primary level in 30 min. At 3 min following the admi

3、nistration of Radix Ginseng (RG) and Andi, the cAMP concentration rose rapidly, reached the peak value at 15 min, then declined gradually and recovered to the primary level in 180 min. cAMP of RG and Andi reached a higher level than that of VB (P0.05 or P0.01); Andi obviously increased the cAMP conc

4、entration in murine peritoneal macrophages in a dose and effect dependent manner at 648 gL-1. CONCLUSION: Andi can increase the cAMP concentration in murine peritoneal macrophages, which may partly accounts for the mechanism of Andi in improving the mice immune functions. 【Keywords】 Traditional Chin

5、ese Medicine; cAMP; macroghages; mice 【摘要】 目的： 观察中药安迪粉针剂(Andi)对小鼠巨噬细胞(M)cAMP 含量的影响. 方法： 采用细胞培养和竞争性蛋白结合分析法测定小鼠腹腔 M 中 cAMP 含量. 结果： cAMP 水平的变化具有规律性：VB在 3 min 以内可引起小鼠腹腔 M 中 cAMP 浓度快速升高，6 min 时达到峰值，之后缓慢下降，至 30 min 时基本恢复原来水平. RG 和 Andi 则是3 min 开始升高，到 15 min 达峰值，然后逐渐下降，180 min 时已基本恢复至原来水平；其升高程度显著高于 VB（P0.0

6、5） ； Andi 能明显引起小鼠腹腔 M cAMP 升高，并在（648） gL-1 剂量范围时呈量效依赖关系. 结论： Andi 引起小鼠 McAMP 浓度升高，可能是Andi 提高小鼠免疫功能的机制之一. 【关键词】 中药；cAMP；巨噬细胞；小鼠 0 引言 蟾酥和人参皂甙具有抗肿瘤作用已有报道1，2 ，不少学者在人参“扶正固本”的作用机制研究中发现，人参具有免疫增强作用，认为人参的抗肿瘤作用是通过提高动物的免疫功能而介导的. 目前的研究证实人参皂甙能促进混合淋巴细胞培养反应，促进未经纯化的脾细胞在体外的增殖，增强 DNA 多聚酶 的活性以及促进白细胞介素 2 的分泌等3. Andi 系第

7、四军医大学药物研究所研制的主治原发性肝癌的抗肿瘤新药，其基础和临床试验1-6均证实，蟾酥和人参不仅具有较好抗肿瘤作用，而且具有明显提高机体免疫功能的作用. Andi 是根据原发性肝癌的发病机制和临床特征设计的中药复方抗癌制剂. 在我们以往的研究工作中已经证实：Andi 能抑制 Lewis 肺癌、S180 实体型以及 HCA 实体型等实体瘤的增长，能明显增加荷 S180 腹水型和荷 HCA 腹水型小鼠的生命延长率，其抗肿瘤作用的强弱呈剂量依赖关系；且对小鼠体液和细胞免疫无抑制作用. 孙纪元等7，8研究还证明：Andi 对小鼠再生障碍性贫血（AA）具有显著治疗作用，能明显升高 AA 血象，刺激骨髓

8、细胞和造血干细胞生长等作用. 我们采用放射免疫测定技术，研究 Andi 对小鼠腹腔巨噬细胞(M)cAMP 的影响，以探讨 Andi 的作用机制. 1 材料和方法 1.1 材料蟾酥醇提液（venenum bufonis，VB；批号：20011012） 、人参醇提液(radix ginseng, RG；批号：20011012)及 Andi 粉针剂(批号：20011012)均由第四军医大学药物研究所制备. 实验样品以 RPMI 1640 培养基或 Hepes 缓冲液配成所需浓度，膜过滤，4保存. RPMI 1640 培养基：Gibco 生命技术公司产品，使用时配成 RPMI 1640 完全培养基，内

9、含：25 mmoLL-1 Hepes,2 mmoLL-1 L 谷胺酰胺、100 UmL-1 青霉素、0.1 gL-1 链霉素、2 gL-1 NaHCO3, 100 gL-1 胎牛血清(FCS)，(杭州四季青牛场). 环磷酸腺苷测定药盒：中国原子能科学研究院产品. Hepes 缓冲液；Hanks 液；TrisHCl 缓冲液. BALB/c 小鼠，6 周龄，体质量（18.51.1）g，由第四军医大学实验动物中心提供（动物合格证号：医动字 08013 号） ，实验室温度为 2225，常规饲料喂养，饮水量不限. 1.2 巨噬细胞(M)的培养与加药按文献9方法无菌取小鼠腹腔M，经苔盼蓝染色细胞活率 95

10、%以上，调整细胞浓度为（110811010）L-1，接种于多孔培养板中，置含 50 mLL-1 CO2, 950 mLL-1 空气孵箱中，37孵育 24 h. 对照组（CON）及稀释用液均以 RPMI 1640 完全培养基作代品. 每组每个时间点设复管 5 个. 1.3M 中环磷酸腺苷(cAMP)的测定按文献10方法进行 1.3.1 样品处理各组实验样品按设计培养的时间取 M，冰浴超声粉碎，3000 rmin-110 min 离心，上清液在 7075水浴下蒸干，干渣溶于适量的 TE 缓冲液(pH 7.5)中测定. 1.3.2cAMP 的测定冰浴条件下，按顺序向编号试管内加入试剂和结合蛋白后轻轻

11、摇匀；培养 2 h，除 CT 管外，每管加入吸附剂 50 L，摇匀，1000 rmin-16 min 离心；吸取上清 120 L，置测量杯中，加 1.5 mL 无水乙醇，摇匀，再加入闪烁液 3.5 mL，充分混匀、加盖，用液体闪烁仪测定放射性比活度. 测得的结果按标准曲线计算样品中 cAMP含量. 统计学处理：测得数据用 SPLM 软件进行统计分析，统计方法为重复测量方差分析. 2 结果 分别以 6, 12, 24 和 48 gL-1 VB, RG 和 Andi 按 3, 6, 15, 30, 60 min 作用于小鼠 MM 中 cAMP 基础水平值为(1.840.22)2.5104 pmoL

12、L-1 ；测得其中 cAMP 含量(Tab 1). VB 在 3 min 以内可引起小鼠腹腔 M 中 cAMP 浓度快速升高，6 min 时达到峰值，之后缓慢下降，至 30 min 时基本恢复原来水平. RG 和 Andi 则是 3 min开始升高，到 15 min 达峰值，然后逐渐下降，180min 时已降至原来水平；其升高程度显著高于 VB. 在 15 min 时考察 RG 与 cAMP 之间的量效关系，可见随着 RG 浓度的升高，cAMP 浓度也随之升高，二者的相关系数r=0.9749，表明 RG 引起 M 中 cAMP 含量的变化具有剂量相关性. 表 1VB, RG 和 Andi 对小

13、鼠腹腔巨噬细胞 cAMP 含量的影响（略） Tab 1cAMP in Murine Peritoneal Macrophages after ip.VB, RG and Andi(略) 3 讨论 VB 在 3 min 以内虽能引起小鼠腹腔 M 中 cAMP 浓度快速升高，6 min 时达到峰值，之后很快下降，至 30 min 时基本恢复原来水平，而且cAMP 升高的水平仅是 RG 和 Andi 的一半（左右）. 说明 VB 升高 cAMP 的作用较弱，而且短暂. 有学者报道 VB 对辐射性损伤所致全血细胞（血象）减少具有显著升高作用，并提高荷瘤动物的免疫功能11. 本试验结果也得出基本一致的结

14、论. Iyengar12报道 G 蛋白在 cAMP 系统中起核心作用. 受体活化通过 G 蛋白耦联到腺苷酸环化酶上，由 G 蛋白决定该酶活性的兴奋或抑制，从而决定 cAMP 浓度的升降而制约细胞的各种效应.cAMP 的信使作用则通过对依赖 cAMP 蛋白激酶(PKA)所调控.在我们的实验中观察到，VB，RG和 Andi 可剂量依赖性的引起小鼠腹腔 M 内 cAMP 浓度快速升高，从其作用表达的时间分析表明，应该是 RG 和 Andi 产生的效应. 可能是 3 种试药首先激活兴奋性 G 蛋白，并在 ATP 的作用下活化腺苷酸环化酶，再引起 cAMP 浓度的升高，但 cAMP 的全部效应均通过 P

15、KA 使其底物发生特异性磷酸化而实现. 这提示我们，RG 和 Andi 通过引起小鼠腹腔 M 中cAMP 浓度的升高，从而引起 PKA 的活化，激活 M. 这很可能是 RG 和Andi 增强小鼠免疫功能的重要途径或作用机制. 【参考文献】 1 Editid by Jiangsu new medicine coLlege. Great glossary of Chinese traditional medicine （below volume） M. Shanghai: Shanghai Renmin Chubanshe (Shanghai Peoples Press), 1977:2715.

16、2 Editid by Jiangsu new medicine college. Great glossary of Chinese traditional medicine （up volume） M. Shanghai: Shanghai Renmin Chubanshe (Shanghai Peoples Press), 1977:32. 3 State administration of traditional Chinese medicine. Chinese herbal medicine.（up volume） M. Shanghai: Shanghai Kexue Jishu

17、 Chubanshe (Shanghai Science and Technology Press), 1998: 1274-1280. 4 Wang SW, Xie YH, Li YR, Lin HS, Zhu LZ. Antineoplastic effects and shorttime effect on advanced alimentary tract new plasms of Chinese herbs Antike J. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi (World Chin J Diestol), 1997;7(3):236-239. 5 Wang

18、SW, Xie YH, Zhu LZ. Antitumor mechanism of Antike J . Disi Junyi Daxue Xuebao (J Fourth Mil Med Univ), 1997;18(4):368-369. 6 Liang J, Sun JY, Xie YH, Wang SW, Li YR. Inducement of differentiation of HL60 cells by Chinese medicine Andi J. Disi Junyi Daxue Xuebao (J Fourth Mil Med Univ), 2002;23(4):31

19、8-319. 7 Sun JY, Wang SW, Xie YH, Shi XY. Experimental study on animal model of aplastic anemia J. Zhongguo Shiyan Dongwuxue Zazhi (Chin J Lab Animal Sci), 2000;10(4):210-212. 8 Sun JY, Xie YH, Wang SW, Li Q, Liang KM. Pharmacodynamics of Andi in aplastic anemia mice J. Disi Junyi Daxue Xuebao (J Fo

20、urth Mil Med Univ), 2002;23（4）:329. 9 E Z. Tissue culture technic M. Secondly edition. Beijing: Renmin Weisheng Chubanshe (Peoples Medical Publishing House), 1993:185. 10 Lin SG. Cell signal transduction system M. Tianjin: Tianjin Kexue Jishu Chubanshe (Tianjin Science and Technology Press), 1996:10

21、6. 11 State administration of traditional Chinese medicine. Chinese herbal medicine （below volume） M. Shanghai: Shanghai Kexue Jishu Chubanshe (Shanghai Science and Technology Press), 1998:2447-2455. 12 Iyengar R. Molecular and Functional Diversity of Mammalian Gsstimulated Adenylyl Cyclases J. FASEB J, 1993;7(9):768-769.