重组酶Cre的逆转录病毒载体的构建及鉴定.doc

1、重组酶 Cre 的逆转录病毒载体的构建及鉴定作者：陆群 吴补领 张洪伟 王冀姝 韩骅 余擎 苏凌云 【关键词】 逆转录病毒 关键词: 重组，遗传;基因剔除;逆转录病毒;遗传载体 摘 要:目的 构建表达重组酶 Cre 的逆转录病毒载体并进行初步的体外感染研究. 方法 将 Cre 基因片段插入到逆转录病毒载体 pMx-IRES-GFP 中，转染包装细胞系获得表达 Cre 的病毒颗粒，体外感染 NIH-3T3 细胞，通过绿色荧光蛋白 GFP 测定病毒滴度. 结果 构建了表达 Cre 的逆转录病毒载体 pMx-IRES-GFP-Cre.通过包装细胞系得到的含有病毒颗粒的培养上清，这种培养上清具有体外感

2、染细胞的能力，病毒滴度为 105 cfu mL-1 . 结论 用逆转录病毒体系表达重组酶 Cre 并能有效地进行体外感染.为用这一方法在体外研究特异基因对细胞生物学行为的影响奠定基础. Keywords:recombination，genetic;gene knockout;retro-virus;genetic vector Abstract:AIM To construct recombinase Cre expressing retrovirus expression vector and infect the mouse host cell in vitro.METHODS Cre g

3、ene was inserted into retrovirus expression vector pMx-IRES-GFP and the packing cell line was transfected to produce retrovirus particles.Retrovirus particles infected NIH-3T3cells in vitro，and the virus titer was determined by green lusaferase protein.RESULTS Re-combinase Cre expressing retrovirus

4、expression vector pMx-IRES-GFP-Cre was constructed successfully，and the packing cell line was able to produce retrovirus particles.The virus titer was105 cfu mL-1 .CONCLUSION Recombinase Cre would be expressed by retrovirus expression system，and the retrovirus particles can infect the host cells eff

5、ectively.This system will be helpful in studying the function of specific gene. 0 引言 Cre 是 P1 噬菌体表达的重组酶，可以特异地识别基因组上的 LoxP 位点并对之进行切割和重组.任何基因的两侧含有 LoxP 位点（floxed 基因） ，都可以被 Cre 重组酶剪切1 .因此 Cre-LoxP 系统目前成为一种普遍应用的条件性剔除基因的方法;为了研究 Cre 重组酶在体外细胞水平对LoxP 位点的识别和剪切的能力，我们利用逆转录病毒载体 pMx-IRES-GFP表达 Cre 重组酶，用重组的逆转录病毒感

6、染体外培养的细胞，从而达到携带 Cre 进入体外培养的细胞. 1 材料和方法 1.1 材料 细菌与质粒:大肠杆菌 XL-10，质粒 pSP72（Promega 公司） ，逆转录病毒载体 pMx-IRES-GFP.细胞系 NIH3T3 和 PLAT-E（均由第四军医大学医学遗传学与发育生物学教研室韩骅教授惠赠）.试剂:限制性核酸内切酶和修饰酶（TaKaRa 公司和 Gibicol 公司）细菌 LB 培养基（Promega 公司） ，小提质粒提取试剂盒和核酸凝胶回收试剂盒（上海华舜生物技术公司） ，磷酸钙共沉淀细胞转染试剂盒 cellphect transfention kit（Pharmacia

7、 公司）.仪器:37和 30普通培养箱（重庆四达公司）.30摇床（哈尔滨东联电子技术有限公司） ，DNA 电泳仪（北京东方仪器公司） ，凝胶成相系统（Alpha innate-ch 公司） ，低温冷冻离心机（Beckman 公司） ，倒置显微镜（Laika 公司） ，荧光显微镜（Olympus 公司）.CO2 恒温孵箱（Nuaire 公司） ，超净工作台（Super 公司）. 1.2 方法 1.2.1 构建表达 Cre 逆转录病毒重组 DNA 用 Bgl，Sal双酶切pSP72 质粒，凝胶电泳，小量胶回收以获得 Cre 基因片段，将其顺式插入逆转录病毒载体 pMx-IRES-GFP 的 Bam

8、H，Xho酶切位点.转化感受态细胞扩增，小量质粒快速抽提纯化得到 pMx-IRES-GFP-CreN. 1.2.2 鉴定 pMx-IRES-GFP-Cre 重组质粒 根据质粒图谱，选用 4 种酶以 4 种方式切开 pMx-IRES-GFP-Cre 重组质粒，Not，BamH，Not和 Bgl双酶切;Cla和 Bgl双酶切. 1.2.3 转染逆转录病毒包装细胞系 包装细胞 PLAT-E 培养于 DMEM培养液（添加有 100mL L-1 胎牛血清，2mol L-1 L-谷氨酰胺及青、链霉素）中. 用 Pharmacia 公司的磷酸钙共沉淀法转染试剂盒（cellphect transfection

9、 kit）进行细胞转染.转染前，将 1105 细胞接种于 6 孔培养板中过夜培养，使细胞生长到汇合率为 40%60%.取 1g 待转染DNA 与试剂盒提供的 CaCl2 溶液（缓冲液 A）混合，室温孵育 10min 后，加入试剂盒提供的磷酸缓冲液（缓冲液 B） ，立即混合后放于室温 15min使沉淀形成.将形成的 DNA-磷酸钙沉淀加入细胞培养液，培养 12h 后用培养液洗细胞，用 150mL L-1 等渗甘油溶液处理细胞 3min，再更换成普通培养液.继续培养 48h 后，收集培养上清-70保存. 1.2.4 体外用逆转录病毒颗粒感染细胞 逆转录载体转染包装细胞系 PLAT-E，收集培养上清

10、直接加入到 NIH3T3 细胞的培养上清中，培养3d，用 40mL L-1 多聚甲醛固定，荧光显微镜下观察并照相. 2 结果 2.1 重组质粒构建及初步鉴定 将 Cre 基因插入到逆转录病毒载体pMx-IRES-GFP 中相应的酶切位点（Fig1）.用多种限制性内切酶进行酶切鉴定，凝胶电泳片段大小与预期的结果完全相同（Fig2）. 图 1 构建表达 Cre 的逆转录病毒质粒示意图 略 2.2 重组的逆转录病毒体外感染细胞 用磷酸钙转染法将重组的逆转录病毒载体转入包装细胞系，正常条件下培养 48h，收集培养上清，得到重组的逆转录病毒.将含有重组逆转录病毒载体的上清加入 NIH-3T3 细胞系培养

11、液中，在正常条件下孵育 3d.荧光显微镜观察.表达绿色荧光的细胞约占 50%，病毒滴度约为 105 cfu mL-1 .同时将空载体转入作为对照，荧光镜下观察绿色荧光细胞占约 51%，与实验组近似. 3 讨论 Cre-LoxP 系统是目前一种普遍应用的条件性剔除基因的方法.这一方法是首先培育在目的基因的两侧插有 LoxP 位点的小鼠，即条件剔除性小鼠2 ，同时培育 Cre 转基因小鼠，两种小鼠交配后即可得到被 Cre切除了目的基因的小鼠.为了研究 Cre 重组酶在体外细胞水平对 LoxP 位点的识别和剪切的能力，以及在体外研究条件性剔除的基因对细胞增殖分化的影响，我们利用逆转录病毒载体表达 C

12、re 重组酶，并在体外感染培养的细胞，从而达到携带 Cre 进入体外培养的条件剔除基因的小鼠的细胞中3 . 图 2 酶切鉴定质粒电泳图 略 我们首先构建了可表达 Cre 的逆转录病毒质粒，这一载体含有一个绿色荧光蛋白的基因（GFP） ，可以和 Cre 同时独立表达4，5 .表达了 GFP 的细胞在荧光显微镜下呈现为绿色，这样的细胞也同时能够表达Cre.因此，能够对 Cre 表达的情况进行观察.结果表明我们建立的这一系统能够在体外有效地感染小鼠 细胞系 NIH3T3，病毒滴度约为 105 cfu mL-1 . 与其他类型的外源基因转导的方法相比，反转录病毒系统具有转导效率高优点6，7 .这种逆转

13、录病毒载体系统建立成功后，可以通过这种方法便捷地观察剔除了目的基因的细胞的生物学变化. 总之，利用逆转录病毒载体将外源基因导入细胞中是目前一种效率高操作简便的方法.我们利用逆转录病毒载体表达重组酶 Cre，并初步验证了它的感染效率，为这一系统在体外研究特异基因对细胞生物学行为的影响奠定基础. 参考文献: 1Xu X，Li C，Garrett-Beal L，Larson D，Wynshaw-Boris A，Deng CX.Direct removal in the mouse of a floxed neo gene from a three-loxp conditional knockout

14、allele by two novel ap-proaches J.Genesis，2001;30（1）:1-6. 2Huelsken J，Vogel R，Erdmann B，Cotsarelis G，Birchmeier W.Beta-Catenin controls hair follicle morphogenesis and stem cell differentiation in the skin J.Cell，2001;18，105（4）:533-545. 3Le Y，Sauer B.Conditional gene knockout using Cre recombi-nase

15、J.Mol Biotechnol，2001;17（3）:269-275. 4Gagneten S， Le Y，Miller J，Sauer B.Brief expression of a GFP cre fusion gene in embryonic stem cells allows rapid retrieval of site-specific genomic deletions J.Nucleic Acids Res，1997;25（16）:3326-3331. 5Rossant J，McMahon A.”Cre”-ating mouse mutants A meeting revi

16、ew on conditional mouse genetics J.Genes Dev，1999;13（2）:142-145. 6Zhukova E，Sinnett-Smith J，Rozengurt E.Protein kinase D po-tentiates DNA synthesis and cell proliferation induced by bombesin，vasopressin or phorbol esters in Swiss3T3cells J.J Biol Chem，2001;276（43）:40298-40305. 7Lois C，Refaeli Y，Qin X，Van Parijs L.Retroviruses as tools to study the immune system J.Curr Opin Immunol，2001;13（4）:496-504.