重组结核分枝杆菌Mr 38 000蛋白的表达、纯化和鉴定.doc

1、重组结核分枝杆菌 Mr 38 000 蛋白的表达、纯化和鉴定摘要 从 H37Rv 基因组中扩增 Mr38 000 蛋白基因并高效表达和纯化。用 PCR 技术从结核分枝杆菌 H37Rv 基因组中扩增 Mr 38 000 蛋白序列，将其与 pGEM-T-Easy 载体连接转化 E.coli DH5，构建重组克隆载体pGEM-T-Easy/ Mr 38 000，测序正确后将目的基因片断克隆入 pQE-80L原核表达载体并转化 E.coli DH5，IPTG 诱导目的蛋白表达。 经Western-blot 鉴定目的基因与(His)6 融合表达，将已表达的蛋白质通过Ni-NTA 亲和色谱柱进行纯化。PC

2、R 得到结核分枝杆菌 Mr 38 000 蛋白基因，测序结果与 GeBank 中报道的完全一致。SDS-PAGE 显示， 在 Mr 为38.5103 处有相应的蛋白质表达条带，Wesern blot 鉴定为(His)6 融合表达蛋白。经 Ni-NTA 亲和色谱柱进行纯化后可得到纯化的蛋白。成功克隆了铁调节蛋白基因 Mr38 000 蛋白序列，并在 E.coli DH5 高效表达，亲和层析后获得了纯化目的蛋白。关键词 Mr 38 000 蛋白; 表达; 纯化; 结核分枝杆菌；Cloning, Expression and Purification of Mr 38 000 proteinfrom

3、 Mycobacterium tuberculosisZHANG Ming， LI Jin-cheng， LIN Hang(Department of internal neurology, 2. emergency department, the Fu Zhou general hospital, Fu Zhou, 350025, P. R. China)Abstract To obtain Mycobacterium tuberculosis Mr 38 000 protein from H37Rv-DNA, express efficiently in E. coli and purif

4、y the Mr 38 000 proteins. Mr 38 000 protein gene was amplified by PCR from the genome of H37Rv and cloned into pGEM-T-Easy vector. After sequenced, Mr 38 000 protein gene was recombinated expression vector pQE-80L by restriction enzyme digestion, named pQE-80L-Mr 38 000. The plasmid pQE-80L-Mr 38 00

5、0 was transformed into E.coli DH5 and induced by IPTG. Mr 38 000 protein expression was analyzed by SDS-PAGE and confirmed by western blot with mice-specific mAb against (His)6. Mr 38 000 protein gene was identical with GeBank reported. The pQE-80L-Mr 38 000 vector expressed protein with relative mo

6、lecule weight about 38.5 kD, which could be caught by (His)6 mAb. The expressed protein could be purified by Ni-NTA system kit with denative condition. Mr 38 000 protein gene had been successfully cloned and efficiently expressed in E.coli, The results established the basis for further study of the

7、function of Mr 38 000 protein.Key words Mr38 000 protein; expression; purification; Mycobacterium tuberculosis (MTB)结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, MTB）是结核病(tuberculosis, TB)的病原体。其在患者体内主要为细胞内生长。诊断方法的欠缺是结核病流行的重要原因。 目前常用的 PPD 试验，常使 BCG疫苗接种者被误检为阳性1，且对后期结核患者敏感性较低，存在明显不足。近年来， 有研究发现 Mr 38 000 蛋白具有强的免疫原

8、性，而成为结核分枝杆菌抗原的研究热点2, 3，可能成为结核病血清学诊断试剂和疫苗研究的候选抗原之一。为此，我们在原核表达载体中表达结核分枝杆菌 Mr 38 000 蛋白并对其进行了纯化，为进一步研究其抗原性和主要功能提供方便。 材料和方法1.1 材料 MTB 毒株 H37Rv、 DH5 由本室保存 ; pGEM-T-Easy 及Wizard Plus Purification system 购自 Promega 公司；X-gal， 限制性内切酶 BamH, EcoR及 T4-DNA 连接酶，TaqDNA 聚合酶均为 TaKaRa 公司产品；IPTG, DTT, DTE, 小量质粒提取试剂盒均为

9、 Sigma 公司产品，胶回收试剂盒为 Vitagene 公司产品。 1.2 方法1.2.1 引物的设计与合成 根据已发表的 MTB H37Rv 全基因组 Mr 38 000 蛋白基因序列设计引物。上游引物 P1: 5-AGGGGATCCGCGAAAATTCGTTTGCATACGCT-3，含 BamH酶切位点和起始密码子， 下游引物 P2:5-GATGAATTCACGGAGGTTGCTGTCGCGTGGTG-3 中加入EcoR酶切位点。引物由上海生工生物技术有限公司合成。1.2.2 Mr 38 000 片段的扩增 取保存于改良罗氏培养基的 MTB H37Rv 接种于 7H9 液体培养基，37间

10、或振荡培养 23 wk。取 5mL 液体培养物的菌体沉淀重悬于 50L 裂解液（10PCR 绶冲液 5L, 45 g/L 吐温， 5L, 45 g/L, NP-40 5L，20 g/L 蛋白酶 K 0.5L 及水 34.5L）中。于 55水浴 1 h，沸水浴 10 min 灭活蛋白酶 K，离心取上清，用酚/氯仿抽提，无水乙醇沉淀，溶于 50L TE 中， 作为 DNA 模板。PCR 反应体系为：10buffer 5L, dNTPs 5L (2.5mmoL/L)、DNA 模板为1L，P1，P2 引物各 1L (25moL/L)及 Taq 酶 1L，加水至50L。PCR 条件：94变性 40 s，

11、60复性 30 s，72延伸 1.5 min， 30 个循环。1.2.3 PCR 产物的克隆与鉴定 PCR 产物用琼脂糖凝胶电泳回收 DNA 条带。取纯化的 PCR 产物与质粒 pGEM-T-Easy 进行连接反应，转化感受态DH5， 均匀涂布于含有 x-gal (33L) 和异丙基 -D 硫代半乳糖苷IPTG (20L)的 LB 培养皿中， 37培养 16 h， 挑取白色菌落进行酶切鉴定，所获阳性克隆命名为 pGEM-T-Easy- Mr 38 000，送至上海生工生物工程有限公司进行序列测定。1.2.4 目的蛋白的诱导表达 经 BamHI 和 EcoR双酶切后与经同样酶切的pQE-80L

12、载体进行连接反应， 转化感受态 DH5，挑取的阳性克隆命名为 pQE-80L -Mr38 000。在含有氨苄青霉素（100mg/L）的 LB 培养基中过夜培养 pQE-80L- Mr 38 000。按 10%的接种量进行转接，37摇菌 3 h，加入异丙基 -D 硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为 0.5 mmoL/ L，37继续培养 45 h。取 1.5 mL 细菌培养物，8000 g 离心 30 s 收集菌体，加入 2样品缓冲液剧烈振荡混匀，100, 5 min；8000 g 离心 5 min；取上清进行 SDS-PAGE 电泳检测。1.2.5 目的蛋白的 Western blot 分析 将

13、经诱导的 pQE-80L-Mr 38 000和 E.coli DH5 分别制样，进行 12% SDS-PAGE 后以 0.15 mA 恒流电转 2 h 至硝酸纤维素膜上，用 50 g /L 脱脂奶封闭 2 h，PBS 洗涤后加抗 His的单克隆抗体(1:5000 稀释) 4过夜，PBS 洗涤后加入 HRP 标记的羊抗鼠 IgG 抗体，37孵育 1 h。PBS 洗涤后 DAB 显色观察结果。1.2.6 目的蛋白的可溶性分析 大规模培养细菌，诱导表达目的蛋白，收集细菌，超声破菌。离心后将上清和沉淀分别制样，进行 SDS-PAGE 分析。1.2.7 目的蛋白的纯化 根据 Ni-NTA 试剂盒的说明书

14、， 将融合蛋白与NI-NTA 结合， 用不同 pH 值咪唑溶液进行洗脱， 得到纯化产物。2 结果2.1 Mr38 000 蛋白片段的扩增及序列测定 经 30 个循环 PCR 扩增，可得与预计长度相等的片断（图 1） 。 将 DNA 回收后插入 pGEM-T-Easy 载体，经测序证实所扩增的 Mr 38 000 序列与 GeBank 数据库所收录的 Mr 38 000 序列完全一致。M: DNA marker DL2000; 1: Mr 38 000 基因 PCR 产物;图 1 PCR 扩增 Mr 38 000 蛋白基因产物琼脂糖凝胶电泳（10g/L）结果2.2 表达载体的构建 pQE-80L

15、 经 BamHI 和 EcoR双酶切后与 Mr 38 000基因目的片断进行连接反应后，转化感受态 E.coli DH5。 挑取的克隆子进行酶切鉴定，切出约 1151 bp 大小片段的为阳性克隆子(图 2)，命名为 pQE-80L- Mr 38 000。M: DNA marker DL 2000; 1, 2: pQE-80L Mr 38 000; 图 2 pQE-80L- Mr 38 000 重组质粒 BamHI 和 EcoR双酶切鉴定结果 2.3 Mr 38 000 蛋白在 pQE-80L 表达载体中的诱导表达 将 pQE-80L-Mr 38 000 经 37活化过夜，经 IPTG 诱导表达

16、后做 SDS-PAGE 分析，从电泳图中可以看出在 Mr 为 38.5103 一致处出现了一条表达带，表达量约占菌体总蛋白的 20%(图 3)。M：蛋白分子量 marker; 1: 未诱导的 pQE-80L- Mr 38 000 质量重组菌 E.coli DH5; 2-4: 诱导的 pQE-80L- Mr 38 000 质量重组菌 E.coli DH5;图 3 (His)6-Mr 38 000 融合蛋白的 SDS-PAGE 分析2.4 目的蛋白的鉴定 所构建的重组质粒表达的 Mr 38 000 蛋白以带有 6 个组氨酸的融合蛋白的形式出现，使用鼠抗 (His)6 mAb 验证 Mr 38 00

17、0 蛋白的表达。结果显示在 Mr 为 38.5103 处有一显色带，而对照无相应条带(图 4)。M：蛋白分子量 marker; 1 : (His)6-Mr 38 000 protein expression 2. DH5 图 4 (His)6-Mr 38 000 融合蛋白的 Western blot 分析结果2.5 目的蛋白的可溶性分析 将上清和沉淀分别所制样品，进行 SDS-PAGE分析表明表达产物主要在细菌裂解后的沉淀中， 而上清中则很少(图 5)。M：蛋白分子量 marker; 1 : 未诱导的 pQE-80L- Mr 38 000 质量重组菌 E.coli DH5；2：诱导菌超声裂解后

18、沉淀; 3: 诱导菌超声裂解后上清; 图 5 (His)6-Mr38 000 融合蛋白的可溶性分析2.6 目的蛋白的纯化 纯化的产物经 SDS-PAGE 分析可在 Mr 为 38.5103处得到一条清晰的条带(图 6)。M：蛋白分子量 marker; 1: 未诱导的 pQE-80L- Mr 38 000 质量重组菌 E.coli DH5; 2: 诱导的 pQE-80L- Mr 38 000 质量重组菌 E.coli DH5; 3, 4: (His)6-Mr 38 000 纯化蛋白图 6 (His)6-Mr 38 000 融合蛋白的表达及纯化3 讨论 Mr 38 000 蛋白是一种磷酸盐转运蛋白

19、，含有对结核分枝杆菌特异单克隆抗体定位的 7 个表位，具有较强的抗原性，已经得到了结核病研究学者们的一致认可。1992 年，Bothamley4等认为 Mr 38 000 蛋白是研究菌阴性肺结核最有用的抗原之一。2006 年 Mark5等通过蛋白质基因芯片和病人血清筛选，发现 Mr 38 000 蛋白是空洞性肺结核所特有的蛋白抗原。本实验中应用的 pQE-80L 表达载体为 4751bp，起始码下游接有 6 个组氨酸，双链环状，Amp 抗性，多克隆位点有 17 个单一限制性酶切位点。PCR产物共有约 1150 bp，与 Mr 38 000 蛋白基因大小相符合。Mr 38 000 克隆入 pQE

20、-80L 载体中与 6 个组氨酸融合，可产生共约 390 个氨基酸的融合蛋白，Mr 为 38.5103 左右，实验结果与理论值相符合。融合蛋白有(His)6 的表达，因此通过检测组氨酸的表达，可间接证明 Mr 38 000 蛋白表达，同时(His)6 的表达为进一步纯化蛋白提供了亲和位点，它可与Ni+特异性结合，通过 Ni-NTA 亲和色谱柱可得到纯化的目的蛋白。我们在原核表达系统中成功表达结核分枝杆菌的 Mr 38 000 蛋白， 并进行了初步鉴定和纯化，为下一步深入研究 Mr 38 000 蛋白的功能奠定了基础。参 考 文 献1Britton WJ,Palengira. Improving

21、 vaccines against tuberculosis J. Immunal Cell Biol, 2003: 81(1): 3445.2World Health Organization Global Tuberculosis Control-Surveillance, Planning, Financing,WHO Repot 2005, World Health Origanization, Gengeva.3Laal S, Skeiky Y A. Immune-based methods, in Tuberculosis and the Tubercle BacillusJ. A

22、merican Society for Microbiology Press, Washington, D.C. 2005, 7183.4Bothamley G H, R Rudd, F Festenstein. Clinical value of the measurement of Mycobacterium tubercuosis specific antibody in pulmonary tuberculosis J. Zthorax, 1992, 47: 270275. 5Mark J, Sartain, Rlayden A, et al. Disease State Differentiation and Identification of Tuberculosis Biomarkers Via Native Antigen Array Profiling J. Molecular Cellular Proteomics, 2005, 5: 20122113. J359-120716-0030