大鼠海马锥体神经元延迟整流钾电流的发育变化.doc

1、大鼠海马锥体神经元延迟整流钾电流的发育变化【摘要】 目的 研究大鼠海马锥体细胞延迟整流钾电流（IK）在出生后不同发育阶段的变化。方法 采用膜片钳全细胞记录模式比较 3 个不同年龄组，即出生后 710 天（P7-10 组） 、2530 天（P25-30 组）和5660 天（P56-60 组）Wistar 大鼠急性分离的海马锥体神经元 IK 的变化及通道动力学和药理学特征。结果 随着动物的发育，IK 的电流密度上调，由 P7-10 的(3213) pA/pF 逐渐增加到 P25-30 的(6420) pA/pF和 P56-60 的(7018) pA/pF。随年龄增大，IK 的激活曲线左移，其半数最

2、大激活电位（V1/2）由-12.2 mV 逐渐增加到-17.8 mV，而斜率因子无明显变化。四乙铵（TEA）可剂量依赖性地抑制 IK，其中 P7-10 组的 IK对低浓度的 TEA（2 和 5 mmol/L）较 P25-30 及 P56-60 组更敏感。结论 在大鼠海马锥体神经元的发育过程中 IK 逐渐增加，并伴有通道激活动力学和药理学特性的改变。上述变化可能与海马锥体神经元的成熟以及认知功能的日益完善有关。 【关键词】 海马锥体细胞 延迟整流钾电流 发育 膜片钳 Abstract：Objective To study the developmental properties of delay

3、ed rectifier potassium currents (IK) in maturing hippocampal pyramidal neurons.Methods Whole cell configuration of the patch-clamp techniques were used to define the characters of IK in the maturing hippocampal pyramidal neurons acutely isolated from Wistar rasts of three postnatal age groups: P7-10

4、, P25-30 and P56-60.Results With the postnatal age increasing, the expression of IK was upregulated from 32 pA/pF in P7-10 group to 64 pA/pF in P25-30 and 70 pA/pF in P56-60 group. The steady-state activation curves of IK in hippocampal pyramidal neurons showed a left shift and the half-activation p

5、otentials (V1/2) changed from -12.2 mV (slope factor k=13.8) in P7-10 group to -16.7 mV (k=14.0) and -17.8 mV (k=13.7) in P25-30 and P56-60 groups respectively. TEA could reduce IK in a dose-dependent manner. IK of P7-10 was found more sensitive to 2 mmol/L and 5 mmol/L TEA than that of P25-30 and P

6、56-60.Conclusion These results indicate that the current density of IK increases with the postnatal development, which may be related to the maturation of hippocampal neurons and the progress of human cognition. Key words: hippocampal pyramidal neuron; delayed rectifier potassium current; developmen

7、t; patch clamp technique 海马 CA1 区锥体细胞在中枢信息处理及认知过程中起重要作用。电压敏感性钾通道在调节神经元兴奋性及维持海马神经元正常生理功能中起关键作用，如参与神经元细胞膜复极，调节动作电位的幅度、时程及发放频率，影响钙离子内流以及神经递质的释放等1-2 。现已明确，在海马神经元存在多种类型的钾通道，其中延迟整流钾通道（delayed rectifier potassium channel，其电流简称为 IK）在神经元细胞膜复极过程中起重要作用，它调节着神经元冲动的发放和自律性3-4 。研究表明，在出生后随年龄增长，海马 CA1 区的细胞膜电生理特性和突触反应

8、性均有显著改变，这些变化可能与神经元发育过程中细胞膜离子通道的表达及功能的变化密切相关5 。本实验旨在研究大鼠海马锥体细胞 IK 在出生后不同发育阶段的变化，以探讨该电流与神经发育及正常脑功能的关系。 1 材料和方法 1.1 实验动物及分组 雄性 Wistar 大鼠（由中国医学科学院实验动物中心提供） ，根据年龄分为 3 组，即出生后 710 天组（P7-10 组） 、出生后 2530 天组（P25-30 组）和出生后 5660 天组（P56-60 组） 。 1.2 大鼠海马锥体神经元的急性分离 参照文献6介绍的方法加以改进分离单个的海马锥体神经元。大鼠迅速断头、取脑，置于充氧（95% O2+

9、5% CO2）冰冷（04）人工脑脊液（ ACSF）中 成分（mmol/L）：NaCl 126，KCl 5，NaH2PO4 1.25，MgSO4 2，NaHCO3 26，葡萄糖 10，CaCl2 2，pH 7.20 ，于冰盒上分离海马，并将海马切成400500 m 的薄片（冠状切片） ，随后将脑片移入充氧的 ACSF 内孵育1 h，将脑片移入充氧的含 0.05% 胰蛋白酶的恒温（32）ACSF 内酶解30 min ，以正常充氧的 ACSF 冲洗 23 遍，然后将脑片移入充氧的含0.05% 蛋白酶 E 的恒温（32）ACSF 内酶解 30 min，以正常充氧的 ACSF冲洗 23 遍，即可将脑片置

10、于室温充氧的 ACSF 中保存。在开始膜片钳实验前，取 12 片脑片移入 2 ml ACSF 中，以火抛光的 Pasteur 吸管（500、300、150 m）顺序吹打，静置 10 min，取上清经金属网过滤加入细胞池内，静置 1520 min，于显微镜下可见大量的单个海马锥体神经元。 1.3 膜片钳全细胞模式记录 以台氏液成分（mmol/L）：氯化胆碱 120, KCl 6, MgCl2 10, 葡萄糖 20, HEPES 10, 以 KOH 调节 pH 至7.30 灌流分离好的细胞，流速 1.5 ml/min。玻璃微电极（原料GG17，外径 1.5 mm，中国科学院上海脑研究所提供）由 P

11、P-83 型拉制仪（日本 Narishige 公司）分两步拉制，充灌电极内液成分（mmol/L）：KCl 140， MgCl2 0.5， EGTA 10， HEPES 10， 以 KOH 调节 pH 至7.20后电阻为 45 M。选择细胞表面光滑、细胞内无颗粒、无空泡的健康锥体细胞，采用高阻封接技术，负压破膜，形成全细胞记录。EPC-9 型膜片钳放大器（德国 HEKA 公司）通过 ITC-16 连接 IBM 微型计算机，应用 PULSE 程序进行刺激发放和信号采集，结果存于计算机内，以备分析。 1. 4 电流记录和分析方法 破膜后细胞膜电位钳制在-50 mV，首先超极化至-110 mV，持续

12、150 ms，然后除极到-50 mV，持续 50 ms，随后以步长 10 mV 的阶跃刺激从-50 mV 至+40 mV 除极 150 ms，测量每次阶跃除极刺激末端（150 ms）处的电流，即为 IK 电流。采用 GPIP 软件，以 Boltzmann 方程拟合稳态激活曲线： G/Gmax=1/1+exp-（V-V1/2）/k，其中 G/Gmax 是通道的电导百分数，V 为去极化膜电位，V1/2 是半数最大激活膜电位，k 为斜率因子。 1.5 给药系统 采用美国 ALA 公司的 BPS-4 灌流系统给药，控制流速为 11.5 ml/min，灌流液温度维持在室温（2224） 。ACSF、台氏液

13、及药物均在实验当天配制。其中四乙铵（TEA） 、4-氨基吡啶（4-AP） 、胰蛋白酶、蛋白酶 E、HEPES、EGTA 为 Sigma 公司产品，其余试剂均为国产分析纯。 1. 6 统计学处理 所有数据均以s 表示，采用两样本均数的 t 检验进行统计学处理，P0.05 为差异有显著性。 2 结 果 2. 1 IK 电流的记录及发育变化 采用氯化胆碱完全取代灌流液中的 Na+，以排除 Na+电流的干扰。在所研究的 3 组动物海马锥体细胞中，均可记录到 IK 电流。图显示发育过程中 IK 电流幅度的变化。当除极到+30 mV 时，3 个年龄组海马 IK 峰值电流密度、电流幅度及细胞膜电容的变化见表

14、，可见随年龄增大，IK 电流幅度及密度均上调，而 P25-30和 P56-60 2 组间未见显著性改变。 2.2 IK 电流的激活动力学变化 根据所记录到的 IK 电流，研究了出生后发育过程中海马锥体神经元 IK 电流的稳态激活动力学的变化，结果表明随年龄增大，IK 的稳态激活曲线左移，其半数最大激活电位（V1/2）由-12.2 mV 逐渐增加到-17.8 mV，而斜率因子基本不变（图2、表 2） 。不同年龄组的 V1/2 和 k 值比较见表 2。 2.3 IK 电流药理学特征的变化 利用钾电流对 TEA 和 4-AP 敏感性的不同可以区分不同亚型的电压依赖性钾通道。我们研究了 3 个年龄组海

15、马锥体神经元 IK 对不同浓度 TEA 和 4-AP 的敏感性，以探讨在发育过程中是否有钾通道亚型的变化。图 3 显示 TEA 可剂量依赖性地抑制 P7-10、P25-30、P56-60 3 个年龄组的 IK，其中 P7-10 组的 IK 对低浓度的TEA（2 和 5 mmol/L）较 P25-30 及 P56-60 组更敏感，而 20 mmol/L 的TEA 对 3 个年龄组动物的 IK 抑制百分率基本一致,均可抑制约 60%。4-AP也可抑制 IK，但未见剂量依赖性，1 mmol/L 的 4-AP 对 3 组动物所记录的 IK 均可抑制约 20%；而 2 及 5 mmol/L 的 4-AP

16、 对 IK 电流抑制效应无明显增强（图 4） 。表 1 不同年龄组大鼠海马神经元 IK 电流密度的变化表2 不同年龄组大鼠海马神经元 IK 电流稳态激活动力学特征的变 3 讨 论 本实验用膜片钳全细胞记录模式研究了大鼠海马锥体神经元 IK 出生后的发育变化。结果显示，在不同年龄组的海马锥体细胞均可记录到持续存在、基本无自动失活的电压依赖性的外向钾电流（IK） 。随年龄增大，IK 电流幅度及电流密度逐渐增加，而 P25-30 和 P56-60 2 组间未见明显变化，说明 IK 电流变化到达一定年龄后，即趋于稳定。有研究表明在出生后的发育过程中，海马 CA1 区锥体神经元的动作电位幅度增加而时程缩

17、短，提示出生后参与动作电位发生和复极的细胞膜钾通道的亚型和活性可能发生变化。在发育过程中，为适应环境的变化和认知功能的需要，海马神经元可通过离子通道表达的变化以获取神经元的可塑性6-7 。另有研究认为，在未成熟的大鼠海马 CA1 区锥体神经元中，动作电位复极主要依赖瞬间外向钾电流，而在成年海马，则主要依赖 IK 来调控动作电位的复极化和频率5 。这些结果都充分证明在发育过程中 IK 增大，对于维持海马正常的生理功能是必须的。 本实验还发现，P7-10 组海马细胞 IK 的激活动力学特征与 P25-30和 P56-60 2 组间存在一定的差异。随年龄增加，IK 的稳态激活曲线左移，提示在发育过程

18、中，IK 通道的电生理特性发生变化，这可能与钾通道亚型表达的变化有关。目前认为至少有 5 种钾通道基因家族编码的钾通道亚单位具有延迟整流样的特性，其中 Kv1、 Kv2、Kv3 编码的钾通道亚型为延迟整流钾通道，hslo 编码的钾通道亚型是 BKCa，KCNQ 家族编码的是M 型钾通道8-9 。本实验通过研究海马发育过程中 IK 的药理学特征，探讨了 IK 发育过程中的电流成分变化。据其药理学特征，我们认为 IK至少由 3 种独立的电流成分组成：TEA 敏感成分；4-AP 敏感成分；TEA 和 4-AP 均不敏感成分。在发育过程中，4-AP 敏感的电流成分在不同年龄组间无显著变化，而 3 组动

19、物间 TEA 敏感的电流成分存在显著的差别。有文献报道大电导钙离子激活的钾通道（BKCa）对低浓度的 TEA敏感10-11 ，我们的研究发现，P7-10 组海马细胞 IK 对低浓度的 TEA更敏感，提示 BKCa 在 P7-10 组海马细胞 IK 中所占的比例大于成年组大鼠。Grosse 等12研究认为，小鼠海马锥体神经元的 IK 增加可能与Kv1 通道亚单位表达增加有关。研究也表明大鼠脑皮质发育过程中编码延迟整流钾通道的 Kv1.5 mRNA 的表达逐渐增加13 ，提示在海马发育过程中，钾通道表达增加及各种通道亚型比例的改变影响 IK 的电流密度。而 P25-30 和 P56-60 组的大鼠

20、海马神经元锥体细胞电流密度和激活动力学以及药理学特性基本一致，提示 4 周后大鼠海马神经元锥体细胞 IK 已基本发育完善。 【参考文献】 1 Rudy B. Diversity and ubiquity of K channels J. Neuroscience, 1988，25(3): 729-749. 2 Rudy B. Molecular diversity of ion channels and cell function J. Ann N Y Acad Sci, 1999，868(1): 1-12. 3 Pei Q, Burnet PW, Grahame-Smith DG, et a

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