合成肽为抗原免疫层析纸条诊断流行性出血热.doc

1、合成肽为抗原免疫层析纸条诊断流行性出血热作者：李经津，陈新文，周宁，李鸿选 【关键词】 免疫检测, 关键词: 出血热;肽合成;胶体金;免疫检测 摘 要:目的 建立一种以合成肽为抗原的胶体金免疫层析纸条用于检测流行性出血热患者血清中特异性的 IgM，IgG，IgA. 方法 采用戊二醛偶联 8 肽到 BSA 上，用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，标记偶联8 肽，组装成免疫层析试纸条. 结果 胶体金-8 肽免疫层析纸条和流行性出血热患者血清中 IgM，IgG，IgA，出现特异性反应，正常人血清未出现阳性反应，和荧光免疫检测结果比较 IgM 符合率为 100%，IgA 为89%，IgG 为 79%.

2、结论 以肽作抗原方便无污染特异性高制作的免疫层析纸条灵敏度高，简便快速，同时可检测 IgM，IgG，IgA，无须特殊设备，有广泛应用前景. Keywords:hemorrhagic fever;peptide synthesis;Colloidal gold;immunoassay Abstract:AIM To develop colloidal gold immunochroma-tography assay paper with synthesizing peptides as antigen used to assay specific IgM，IgA，IgG of HFRS pati

3、ents in sera.METHODS Eight residual peptides were coupled with BSA using glutaraldehyde.Colloidal gold was prepared with reducing reaction of sodium citrate，and was labeled coupling8residual peptides，was assembled immunochromatography assay papers.RESULTS Colloidal gold-peptides im-munochromatograph

4、y assay papers could detect the specific serum IgM，IgA，IgG of HFRS，and did not detect any reac-tions in normal sera.The results were highly corresponding with the fluorescent immunosassay.Coresponding with IgM is100%，IgA is89%，IgG is79%respenctively.CONCLUSION The antigens using peptides have advant

5、ages of con-venience，noncontamination，high specificity.The im-munochromatography assay papers with the8residual pep-tides is a sensitive，simple and rapid method，may syn-chronously detect the IgM，IgG，IgA in HFRS sera. 0 引言 流行性出血热病原体属布尼亚病毒科，汉坦病毒属，有十多个型1 ，我国仅发现两型，即型（汉滩型，主要由黑线姬鼠携带）和型（汉城型，主要由褐家鼠携带） 2 .在感

6、染的早期患者血液中就可出现核衣壳抗原特异性的 IgM 抗体，7 病日抗体阳性率为 100%，而核衣壳抗原特异性 IgG 抗体可维持 10a 左右3，4 .因此用核衣壳蛋白作抗原是流行性出血热的理想抗原.人工合成的汉坦病毒核衣壳蛋白 8 肽作为抗原，以抗人 IgG，IgM，IgA 包被纤维素膜作为捕获抗体，装配成免疫层析纸条，和荧光免疫检测结果一致，有望成为快速简便的诊断方法. 1 材料和方法 1.1 材料 8 肽抗原由陕西师范大学李铮博士惠赠;氯金酸购自上海试剂一厂（RA）;硝酸纤维素膜（孔径 5.0m，PE 支持） ，玻璃纤维素膜，购自 Whatman 公司;牛血清白蛋白，购自华美公司;羊抗

7、人IgG，IgM，IgA，购自上海生物制品所，单扩效价分别为 1 80，1 100，1 120，其他试剂购自化玻试剂站，均为分析纯.流行性出血热阳性血清由传染病院白韧提供. 1.2 方法 由于 8 肽的羧基端已被封闭，因此只能应用氨基端的自由氨基及 8 肽中的赖氨酸的 位氨基进行偶联.具体方法如下:1g L-1 戊二醛 1mL 滴加于 1mL 出血热 NP8 肽溶液（1g L-1 ）中室温搅拌 3h，再将 2g L-1 的牛血清白蛋白滴入上述戊二醛多肽溶液中室温再搅拌3h，4静置对 0.01mol L-1 ，pH7.4PBS 透析过夜，中间换液 3 次.胶体金的制备及标记;氯金酸用三蒸水（电导

8、率 0.3US/cm）溶液定容为 10g L-1 作为储存液.取 10g L-1 氯金酸溶液 1mL，三蒸水稀释至 100mL，煮沸后加入 10g L-1 柠檬酸 4mL，继续煮沸 5min，溶液由无色变紫再变为深红色.根据予实验计算 8 肽 BSA 结合物对胶体金最佳比率为 1 7，在搅拌下加入偶联 8 肽的 BSA5mL 到上述胶体金溶液 30mL 中，放置室温 2h 后，加入 100g L-1 NaCl 水溶液使含 NaCl 浓度为 10g L-1 ，以 3000r min-1 ，离心 15min，弃沉淀，上清液以 15000r min-1 离心 1h，小心吸去上清液，沉淀物用 0.02

9、mol L-1 ，pH7.4Tris-HCl 缓冲液溶解并加至 1mL，加入 BSA10mg-20冻存.试纸条由 PE 支持硝酸纤维素膜，玻璃纤维素膜，浸胶体金-8 肽-BSA 结合物玻璃纤维素膜，及吸水滤纸用双面胶带粘贴于照相纸上，硝酸纤维素膜上用羊抗人 IgG，IgM，IgA，分别包被成 3 条约为 1.5mm 宽的线条，室温 30min 后，用 0.02mol L-1 ，pH7.4，100g L-1 BSA 的 Tris-HCl 封闭（3730min）室温干燥.玻璃纤维素膜裁成0.5cm2.5cm 浸入上述制得的胶体金-8 肽-BSA 溶液中，充分浸透后取出，室温干燥，组装成 2.5cm

10、8cm 的纸卡，剪成 0.3cm8cm 的纸条，4保存.将测试纸条玻璃纤维素端插入血清内约 0.5cm 内数秒钟.取出平放约510min，血清沿纸条到达吸水滤纸端即可.结果判定:3 条包被线条任何一条出现红色线条可判为阳性，3 条均不出现红色线条为阴性. 2 结果 市传染病医院提供 10 份阳性血清及 10 份阴性血清均经荧光免疫检测及临床证实.10 份阳性血清中除一例严重溶血结果难以判断外 9 份用试纸条检测 IgM 均显示阳性，7 份 IgA 阳性，而 IgG 仅 5 例显示阳性.可能与病期较早有关.任意血清检测:均未出现阳性结果.结果 IgM 符合率为100%，IgA 为 89%，IgG

11、 为 79%，显示和荧光抗体检测有较高的符合率. 3 讨论 尽快确诊对防治流行性出血热起着关键作用.目前诊断流行性出血热多采用荧光免疫法及 ELISA，荧光免疫法需要荧光显微镜、抗原片、液氮放置抗原片，在基层操作十分不便，而 ELISA 法需要抗原培养，其操作时间相对较长也有许多不便之处，而出血热多以在田间劳动的青壮年农民最多，因此开发简单易行的试条方法有着特别的意义5 . 我们以胶体金免疫层析法检测流行性出血热患者 IgM，IgA，IgG 抗体，以 8 肽抗原偶联牛血清白蛋白代替培养抗原，取得和荧光免疫及ELISA 较为一致的结果.而且整个检测过程在 10min 中内完成，简单快速，无需设备

12、仪器，可在田间地头及家中进行有着广泛的应用前景.但是，由于我们采用手工包被，其包被浓度均一性变化较大，这也可能是 IgG 检测率较低的一个原因.另外应选择最佳的胶体金量和包被量，以便使该试纸条尽快商品化. 参考文献: 1Sibold C，Ulrich R，Labuda M，Lundkvist A，Martens H，Schtt M，Gerke P，Leitmeyer K，Meisel H，Krger DH.Do-brava Hantavirus causes hemorrhagic fever with renal syndrome in central Europe and is carri

13、ed by two different Apodemus mice species J.J Med Virol，2001;63:158-167. 2Chen HX，Li QI.The effect of HFRS cauaed by flood and wa-terlogging in China J.Zhongguo Gonggong Weisheng Zazhi（Chin Pub Health） ，1999;15（7）:666-667. 3Zhang FL，Xu ZK，Yan Y.Construction expression and gene immunization of eukary

14、otic expression vector containing0.7kb fragment of Hantaan virus S J.Di-si Junyi DaixueXuebao（J Fourth Mil Med Univ） ，2001;22（14）:1287-1289. 4Li Z，Bai XF，Bian HJ.Preparation of the major antigenic epi-tope of Hantaan virus nucleocapsid protein and its application J.Di-si Junyi Daixue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ） ，2001;22（8）:691-695. 5Park JM，Cho SY，Hwang YK，Um SH，Kim WJ，Cheong HS，Byun SM.Identification of H-2Kb -restricted T-cell epitopes within the nucleocapsid protein of Hantaan virus and establish-ment of cytotoxic T-cell clones J.J Med Virol，2000;60:189-199.