胎儿有核细胞筛选技术概述.ppt

1、母体外周血胎儿细胞筛选,2011.11.22,背景介绍,美国2006年发布的“全球出生缺陷报告”中显示 ：全世界每年出生缺陷儿超过800万，90%发生在中低收入国家，每年至少有330万 5岁以下儿童死于出生缺陷，约320万存活缺陷儿终生残疾。我国是世界上出生缺陷高发国家之一，全国出生缺陷总发生率约为11- 14，且呈逐年上升趋势。中国每年有约2000万婴儿出生，其中约有20-30万肉眼可见先天畸形儿，加上出生后数月和数年才显现出来的缺陷，中国先天残疾儿童总数高达80-120万，约占每年出生人口总数的4-6。2007年全国前 5位的出生缺陷疾病依次为：先天性心脏病、多指 (趾)、唇裂、神经管缺陷

2、和先天性脑积水，发生率分别为25. 1/万、16. 3/万、13. 1/万、7. 2/万和 6. 8/万。据统计，我国目前的出生缺陷死亡率为30%，残疾率为40%，只有30%可以治愈或纠正。如果对所有存活的出生缺陷和残疾提供治疗、康复和福利，全国每年要投入300亿元人民币。,2,产前诊断,3,又称宫内诊断，是指胎儿出生前采用各种方法预测其是否有先天性疾病（包括畸形和遗传性疾病），为能否继续妊娠提供科学依据。目前真正能做到产前诊断的病种很少，可分以下几类： (1) 染色体病(2) 性连锁遗传病(3) 先天性代谢异常(4) 血液系统遗传病(5) 胎儿的神经管畸形(6) 胎儿先天畸形产前诊断方法包括

3、创伤性方法和非创伤性方法，从形态学、染色体、酶学、代谢产物和基因五个水平进行。目前产前诊断仍以创伤性方法为主，并以羊膜腔穿刺最为常用。,产前诊断方法,4,创伤性产前诊断方法主要包括：绒毛膜穿刺术：采取羊膜囊之外的绒毛膜，进而分析胎儿的染色体，最早可在怀孕10-12周进行。羊膜穿刺术：目的是为取得羊水中的胎儿细胞，在怀孕大约14-20周进行。羊水细胞主要来自胎儿的皮肤、胃肠道、呼吸道、泌尿生殖道的粘膜脱落细胞。经体外培养后，可进行染色体分析、酶和蛋白质检测、性染色质检查、提取DNA作基因分析，也可不经培养，用微量技术作酶和蛋白质分析或直接提取DNA作基因诊断。胎儿镜和胚胎活组织检查：主要用于胎儿

4、血的取样、活检，也可对胎儿形态异常进行观察，于怀孕15-21周进行操作。脐血取样：经母腹抽取胎儿静脉血，可在B超引导下于孕中期、晚期（17-32周）进行。创伤性产前诊断可能引起流产（绒毛膜穿刺1.4-2.7%，羊膜穿刺0.5%）、早产、感染、母体免疫反应、胎儿畸形、甚至胎儿死亡等并发症。非创伤性产前诊断方法主要包括：超声检查X线或核磁共振成像检查母体血清检测：AFP，-hCG等 母体外周血胎儿细胞检测,5,母血中主要存在两种来源的胎儿细胞，一种是胎盘细胞，如合体滋养细胞和细胞滋养细胞；另一种是胎儿血细胞，如淋巴细胞、粒细胞及胎儿有核红细胞。滋养细胞是最早出现在母血中的胎儿细胞（孕4-5周起），

5、但在进行产前诊断最佳时期即孕早期时，只有极少量的滋养细胞出现在母血中。滋养细胞可以在体外培养，但其多核特征及嵌合型核型会干扰遗传学结果分析，不利于用于产前诊断。胎儿淋巴细胞于孕14周出现于母体血循环中。有学者利用HLA-A2抗原作为标记，结合FACS从孕妇外周血中分离到胎儿细胞。但由于HLA抗原系统有较高的个体特异性，且需知道父母双方的HLA类型，所以将它直接用于临床还有一定的困难。同时，由于胎儿淋巴细胞产后可持续存在于母体数年，故诊断可能受既往妊娠的影响。针对胎儿粒细胞的研究较少，可能是特异性单克隆抗体较难寻找。目前认为胎儿有核红细胞是用于产前诊断的最理想细胞类型：从孕6周至分娩持续存在于母

6、体外周血中；每40ml母血中有100-1000个，而正常人外周血中几乎没有；在母血中生命周期较短，约为90天；属单核细胞，含有胎儿的全部遗传信息，且易从形态学上辨别；表达数种特异性抗原，如转铁蛋白受体CD71，以及独特的胎儿血红蛋白, 链等。,母体外周血胎儿细胞,目前许多学者都致力于解决胎儿细胞的识别、富集和如何排除母血的“污染”等。已有用单克隆抗体或以细胞表面特异性抗原的抗体作为标记等来识别胎儿细胞，结合富集和纯化技术的完善，如果方法能更加简便、经济，将可能在遗传病的预防中发挥作用。富集方法：化学方法：根据抗原-抗体结合，如FACS、MACS；物理方法：根据细胞密度或在电场和缓冲液中的迁移，

7、如梯度离心、电泳迁移。纯化技术：胎儿细胞的标记；单细胞操作技术。,外周血胎儿细胞筛选,6,化学富集方法,7,由于母体外周血中循环胎儿细胞很少，并且在富集过程中也存在丢失，故FACS和MACS方法都较难富集到胎儿细胞。,物理富集方法,8,胎儿细胞的纯化一方面基于细胞的标记，另一方面基于单细胞操作。单细胞操作包括显微操作、激光微切割压力弹射 (LMPC)、基于双向电泳 (DEP) 的芯片实验室技术等1。纯化后的单细胞可以通过测序、RT-PCR、QF-PCR等技术来研究胎儿基因组特性。,9,外周血胎儿细胞纯化,International Journal of Molecular Medicine.

8、2008. 21: 3-12.,外周血胎儿细胞纯化,International Journal of Molecular Medicine. 2008. 21: 3-12.,10,International Journal of Molecular Medicine. 2008. 21: 3-12.,11,外周血胎儿细胞分析流程,12,胎儿有核红细胞体外培养,Stem Cells Dev. 2004: 有核红细胞无法在体外培养和增殖。J Cell Biochem. 2011: 目前的学术研究中，通过各种方法体外培养的“胎儿细胞”绝大多数实为母体来源，主要原因是起始的胎儿细胞数量太少。需要更加特

9、异的胎儿细胞标记物，以及利于胎儿细胞优势生长的细胞因子/mitogens。微滴培养系统：通过显微操作和20m针孔微量吸管吸出单个初级胎儿有核红细胞(pFEs)，转移至10l覆盖有无菌矿物油的微滴培养介质，可观察胎儿红细胞体外生长增殖情况。,13,NRBC特异性抗体,International Journal of Molecular Medicine. 2008. 21: 3-12.,14,NRBC阳性筛选,NRBC膜上存在对一些抗体反应阳性的抗原，可以利用这些抗体去识别NRBC。CD71：转铁蛋白受体，是一种胎儿红细胞膜抗原，在fNRBCs上高度表达。它随孕周而增高，并随着胎儿红细胞的成熟而

10、消失，最适宜分离胎儿细胞之用。Diana W Bianchi等单独利用抗CD71抗体进行fNRBCs的分选，对其分选纯度不甚满意，提出应增加另一种特异性抗体进行双标分选 (PNAS. 1990)。FB3-2; H3-3; 2-6B/6: 抗CD71单克隆抗体。Pezzolo A等用MACS方法富集fNRBCs ，然后通过FISH成功检测出胎儿染色体畸变 (Minerva Med. 1997)。2F6.3: 抗CD71的鼠源单克隆抗体。分选fNRBCs效果较好，分选的胎儿细胞受母亲细胞污染少 (J Matern Fetal Neonatal Med. 2004)。GPA (glycophorin

11、 A)：血型糖蛋白A，是在幼稚红细胞和成熟红细胞表面均表达的红细胞特异性血型抗原，在白细胞表面不表达。将CD71+/GPA+细胞作为靶细胞分离，其准确率较单一CD71抗体更高 (中国优生与遗传杂志. 2000)。,15,GPC：血型糖蛋白C，在红细胞膜中浓度较GPA低。JW Choi等用抗GPC抗体标记骨髓增生异常综合征病人的NRBC (Leukemia. 2002)。Hemoglobin：在胚胎发育早期，合成胚胎血红蛋白Hb Gower1(22) 、Hb Gower 2(22)、Hb Portland(22)；胎儿期主要是HbF(22)。链，从孕8w直至胎儿出生均有较高程度的表达，在孕810

12、w HbF为fNRBCs的主要Hb，而成人Hb的主要成分为22，因此应用HbF链的单克隆抗体选择胎儿细胞具有较高的敏感性 (Prenat Diagn. 1997)。链，孕1012w时-Hb阳性细胞显著高于其他妊娠周数。Choolani等在混有男性胎儿红细胞的女性成人骨髓红细胞中证实了抗-Hb单克隆抗体对于fNRBCs的高特异性，对于产前诊断是可行的 (Blood. 2001)。链，是最特异性的fNRBCs标记，而其他胎儿Hb已经被证明在成人中也存在。Morten等用phage display选择Hb抗体，从而增加了特异性和减少了假阳性，对于产前诊断是可行的 (J Biomed Biotechnol. 2009)。,NRBC阳性筛选,16,NRBC阴性筛选,阴性筛选是利用抗母体白细胞特异性抗原的抗体，从而去除母体白细胞成分。CD45：CD45抗原存在于所有白细胞上，但不存在于NRBC上。剔除CD45+细胞可以使阳性选择更有效。CD14：即LPS受体，是一种存在于单核细胞、巨噬细胞等细胞表面的白细胞分化抗原。Christensen B等比较两种富集NRBC的方法，(1) 三步法，密度梯度离心 CD45/CD14阴性选择 CD71阳性选择；(2) 一步法，CD71直接选择。结果使用CD71从母亲血中阳性选择NRBC要比第一种方法好 (Fetal Diagn Ther. 2005)。,