豚鼠螺旋蜗轴动脉SP能神经的结构.doc

1、豚鼠螺旋蜗轴动脉 SP 能神经的结构作者：乔莉 王锦玲 邱建华 刘顺利 【关键词】 螺旋蜗轴动脉 关键词: 螺旋蜗轴动脉;P 物质;免疫组织化学;豚鼠 摘 要:目的 观察豚鼠螺旋蜗轴动脉（SMA）SP 能神经支配的特点. 方法 采用免疫组织化学 ABC 法结合葡萄糖氧化酶-DAB-镍染色技术及免疫透射电镜，探讨 P 物质（SP）在 SMA 上的分布特点. 结果 SMA 近端外膜上存在着大量 SP-IR 阳性神经元.在 SMA 远端外膜上可见大量的 SP-IR阳性神经纤维，相互交错，呈网状结构. 结论 SP 在耳蜗血管的调节过程中可能起着重要作用. Keywords:spiral modiola

2、r arteria;substance P;immunohis-tochemistry;guinea pigs Abstract:AIM To investigate the innervation characteris-tics of SP-immunoreactivity（SP-IR）nerves in the spiral modiolar arteriae of guinea pigs.METHODS Avidin-botin peroxidase complex（ABC）immunostaining combined with the glucose oxidase-diamino

3、benzidine-nickel（GDN）enhance-ment technique was employed for immunohistochemistry，and the distributions of substance P（SP）under light.RESULTS A large number of SP-IR neurones were found existing in the tunicae adventitia vasorum in the proximal ends of SMA.Meanwhile，a large number of SP-IR nerve fib

4、res showing a net-like appearance were found existing in the tunicae adven-titia vasorum in the distal ends of SMA.CONCLUSION SP might play an important role in the regulation on the cochlear blood flow. 0 引言 已有很多实验证实，耳蜗血管除接受交感神经节后纤维的支配外1 ，还受到一些肽类物质的调节2，3 .目前从生理的角度来研究影响耳蜗血流因素的报道较多4-6 ，但螺旋蜗轴动脉（SMA）肽类

5、神经递质或调质的分布状态尚不清楚.我们采用免疫组织化学 ABC 法结合葡萄糖氧化酶-DAB-镍染色技术及透射电镜，探讨 P 物质（substance P，SP）在 SMA 及其分支上的分布特点，为进一步深入研究肽类物质对耳蜗血流的调节作用及其机制，奠定形态学的基础. 1 材料和方法 1.1 材料 兔抗 SP 抗体（使用效价 1 5000，Sigma） ，生物素标记的猪抗兔 IgG 和 ABC 复合物（使用效价 1 200，Sigma）;型葡萄糖氧化酶和 3，3-四盐酸二胺基联苯胺（DAB）均为美国 Sigma 公司产品.耳廓反射灵敏，体质量 320380g 的健康杂色豚鼠 15 只，雌雄不拘.

6、戊巴比妥钠（30mg kg-1 ，ip）麻醉后开胸，经主动脉插管灌注固定7 .先以生理盐水冲出血液，继之灌以 40g L -1 多聚甲醛-0.5mL L-1 戊二醛磷酸缓冲液（PB，0.1mol L-1 ，pH7.4）600800mL，保留滴注 1h.取下颞骨，打开听泡，在解剖显微镜下去除骨性耳蜗，取下蜗轴.在听神经表面剥离螺旋蜗轴动脉.投入 40g L -1 多聚甲醛-磷酸缓冲液中再固定 12h 后，再将标本置于 250g L -l 的蔗糖磷酸缓冲液中（4）直至沉底.标本用磷酸缓冲生理盐水（PBS，0.01mol L-1 ，pH7.4）漂洗. 1.2 方法 将螺旋蜗轴动脉按漂洗法置于反应槽内

7、进行免疫组织化学反应.染色程序按照免疫组织化学 ABC 法，结合葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸镍铵增强显色技术进行8 .第一抗体孵育时间 48h（4） ，第二抗体 12h（室温） ，ABC 复合物 5h（室温）.每次孵育之间用 PBS 漂洗（5min，3 次）.对照试验用 PBS 替代第一抗体进行孵育，其余操作与上述一致.血管铺片反应结束后，将螺旋蜗轴动脉从反应槽中取出并置于载玻片上，滴加蒸馏水 34 滴后于解剖显微镜下按原状铺展血管.铺展完毕后放置空气中自然干燥，随后浸入纯乙醇中脱水（10min，2 次） ，转入二甲苯透明后 DPX 封片. 2 结果 豚鼠 SMA 经免疫组化染色后，阳性结构明显

8、，界限清楚，背景染色浅淡，所有阴性对照未着色.在 SMA 近端的外膜层，可见数量较多的 SP免疫反应阳性的神经元.多为圆形或椭圆形，直径约 3040m，含 35个突起，呈散在分布，并可见由胞体发出的神经纤维（Fig1）.局部放大后，可见 SP-IR 阳性神经元胞质内含有染色较深的点状颗粒（Fig2）.SMA 中段及远端未见 SP-IR 阳性神经元，但血管外膜 SP-IR 阳性纤维密集呈网状，相互交错，粗细不均，有明显的交叉和分支，可见膨体（Fig3）.由 SMA 分出的外上放射状动脉，中放射状动脉以及内上放射状动脉均可见 SP-IR 阳性的神经纤维.但纤维密度以外上放射状动脉为高. 图 1 图

9、 3 略 3 讨论 SP 是最早发现的神经肽，广泛分布于中枢及外周神经系统7-10 ，在血管系统含量也很丰富.早在 1931 年，Von Eluer 等就已证明 SP 有血管扩张及刺激平滑肌的作用，并使血管通透性增加，腺体分泌增多8 .多数学者认为，这一作用的机制可能是由于逆行刺激感觉神经，使周围 C 类无髓鞘的感觉神经末梢释放 SP 所引起 11 .SP 对耳蜗微血管的作用也为一些实验证实.Vass 等12 探讨了辣椒素（capsaicin）对耳蜗血流的作用.发现小脑前下动脉内灌注1550pmol min -1 的 capsaicin，耳蜗血管呈剂量依赖性的扩张;而灌注 150200pmol

10、 min-1 或以上的剂量，经 12min 潜伏期后，产生比较稳定的耳蜗血管扩张.但这一作用可被特异性的 SP 受体拮抗剂（D- ProZ，D-Trp7.9）-SP所抑制13 .该研究表明，从 capsaicin 敏感的 SP 能神经纤维释放的 SP，在调控耳蜗血流方面，可能起着重要作用.本研究在豚鼠 SMA 发现分布广泛的 SP-IR 阳性纤维，从形态学上证实了SMA 受 SP-IR 阳性纤维的支配.尽管目前对支配 SMA 的 SP-IR 阳性纤维是来自感觉神经还是来自副交感神经的节后纤维尚不清楚.但本研究在 SMA近端的血管外膜层，发现数量较多的 SP-IR 阳性的神经元，这些 SP-IR

11、阳性神经元可能是一些中间神经元，既接受来自上位神经元的调控，又发出神经纤维支配螺旋蜗轴动脉及其分支，调节耳蜗血流.提示 SP 在耳蜗血流的局部调节机制中可能起着重要的作用.但是否还存在其他神经肽支配螺旋蜗轴动脉及其分支，还有待进一步研究. 参考文献: 1Ren TY，Laurikainen E，Quirk WS，Miller JH，Nuttall AL.Effects of electrical stimulation of the superior cervical ganglion on cochlear blood flow in guinea pig J.Acta Otolaryngo

12、l（Stockh） ，1993;113（2）:146-151. 2Mclaren GM，Quirk WS，Laurikainen E，Coleman JK，Seidman MD，Dengerink HA，Nuttall AL，Miller JM，Wright JW.Sub-stance P increase cochlear blood flow without changing cochlear electrophysiology in rats J.Hear Res，1993;71（1-2）:183-189. 3Quirk WS，Seidman MD，Laurikainen EA，Nutt

13、all AL，Miller JM.Influence of calcitonin-gene related peptides on cochlear blood flow and eletrophysiology J.Am J Otol，1994;15（1）:56-60. 4Ohlsen A， Hultcrantz E，Engstrom B.The effect of topical ap-plication of vasodilating agents on cochlear electrophysiology J.Acta Otolaryngol（Stockh） ，1993;113（1）:

14、55-61. 5Albera R，Tondolo E，Ferrero V，Pignocchino P，Pallavicino F.The evaluation of isofluranes effect on the cochlear blood flow by laser Doppler flowmetry J.Acta Otorhinolaryngol Ital，1995;15（4）:289-293. 6Preckel MP，Degoute CS，Dubreuil C，Boulud B，Tassard AM，Banssillom V.Effects of buflomedil and na

15、ftidrofuryl on the hu-man cochlear microcirculation measured by laser Doppler J.Rev Laryngol Otol Rhinol Bord，1995;116（1）:69-72. 7Qiu JH，Wang JL，Liu SL，Shu SY.Localization of substance Pin middle ear mucosa and peripheral auditory pathways in guinea pig J.Zhonghua Erbi Yanhouke Zazhi（Chin J Otorhino

16、-laryngol） ，1991;26（3）:1450-1481. 8Seria A，Lundbery JM，Skofitasch G，Boulud B，Tassard AM，Banssillom V.Vascular protein leakage in various tissues in-duced by substance P，capsaicin，bradykinin，serotonin，his-tamine and by antigen challenge J.Arch Pharmacol，1983;324（3）:212-218. 9Liu SL，Qiu JH，Qiao L，Jian

17、g HY，Wang JL.Immunohis-tochemical distribution of substance P and neuropeptide Y in guinea pig olfactory bulb J.Zhonghua Erbi Yanhouke Zazhi（Chin J Otorhinolaryngol） ，1994;2（3）:184. 10Ylikoski J.Neuropeptide-like intraneuronal profiles in the hu-manth cranial nerve J.J Laryngol Otol，1984;98（7）:693-7

18、00. 11Ylikoski J，Parula P.Neuropeptides in the middle ear mucosa J.ORL，1988;50（3）:176-182. 12Vass Z，Bari F，Jancso G.Possible involvement of capsaicin-senstine sensory nerves in the regulation of cochlear blood flow in the guinea pig J.Acta Otolaryngol（Stockh） ，1994;114（2）:156-161. 13Vass Z，Nuttall AL，Coleman JK，Miller JM.Capsaicin-in-duced release of substance P increase cochlear blood flow in the guinea pig J.Hear Res，1995;89（1-2）:86-92.