血小板源性生长因子对人视网膜色素上皮细胞的作用.doc

1、血小板源性生长因子对人视网膜色素上皮细胞的作用作者：司艳芳 惠延年 韩泉洪 杜红俊 【关键词】 生长因子 关键词: 生长因子，血小板源性;人视网膜色素上皮细胞;增殖;移行 摘 要:目的 观察血小板源性生长因子（PDGF）对人视网膜色素上皮细胞（hRPE）增殖和移行能力的影响. 方法 将体外培养的第 46 代人视网膜色素上皮细胞分为 DMEM 组（改良型 Eagle 培养液）和含有20mLL-1 小牛血清的 DMEM 组（20gL-1 DMEM） ，每组分别加入不同浓度（0.1，1，5，10，50 和 100gL-1 ）的PDGF，然后采用 MTT 比色法观察分析其对 hRPE 的增殖作用;应用

2、 hRPE 损伤模型，计数进入缺损区的细胞，定量观察 PDGF 对 hRPE 移行的影响. 结果 增殖作用:0.1100gL-1 的 PDGF 均能促进 hRPE 的增殖，DMEM 组 10gL-1 时促增殖作用最明显，增殖率达153%;20gL-1 DMEM 组 50100gL-1 的增殖率为174%，作用最强.移行作用:PDGF 能够显著促进 hRPE 的移行，并呈剂量依赖性，50100gL-1 时促移行能力最强，DMEM 组移行率为510%，20mLL-1 FBS+DMEM 组达 640%. 结论 PDGF 能够促进hRPE 的增殖和移行，有血清时可以加强这种作用，提示它在 PVR 的发

3、病过程中可能发挥了重要作用. Keywords:platelet-derived growth factor;human retinal pig-ment epithelium cells;proliferation;migration Abstract:AIM To investigate the effects of platelet-derived growth factor on the proliferation and migration of cultured human retinal pigment epithelium cells（hRPE）.METHODS Culture

4、d hRPE of the46th passage were devided into two groups DMEM（Delbeccos modified Eagles medium）and20mLL-1 FCS+DMEM（20gL-1 DMEM）.PDGF（0.1100gL-1 ）was added to medium.RPE prolifera-tion was mesured by colorimetric assay for cellular growth and survival（MTT assay）and Migration was assessed by us-ing an i

5、n vitro wound healing model in which a small area of a confluent monolayer of hRPE was denuded with a razor blade，the cultures were subsequently incubated with medi-um， migration was measured after24hours as the number of cells that had entered the denuded area.RESULTS Pro-liferation:PDGF stimulated

6、 the proliferation of hRPE.The maxium proliferation rate of RPE was153%at10gL-1 in DMEM and174%at50100gL-1 in20gL-1 DMEM.Migration:PDGF also stimulated hRPE migration in a dose-dependent manner.At50100gL-1 ，the maxium migration rate were510%and640%in DMEM and20gL-1 DMEM.CONCLUSION PDGF stimulates hR

7、PE prolif-eration and migration，the presence of serum can increase this effects，which imply that PDGF may play an important role in the development of proliferative vitreoretinopathy. 0 引言 在增生性玻璃体视网膜病变患者的玻璃体和视网膜下液中已检测到明显增高的血小板源性生长因子（PDGF） 1 ，一些体外实验表明，培养的视网膜色素上皮细胞（hRPE）能够自分泌或旁分泌 PDGF 并表达其受体2 .由于该因子对多

8、种细胞有促有丝分裂活性和化学趋化性，而且参与创面愈合的全过程3 ，我们采用体外培养的方法，观察 PDGF 对人视网膜色素上皮细胞（hRPE）增殖和移行能力的影响. 1 材料和方法 1.1 材料 Delbeccos modified Eagles medium（DMEM，Gibco，USA） ，小牛血清（杭州四季青） ，胰酶（Gibco，USA） ，3-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT，Sigma，USA） ，人重组 PDGF-BB（Sigma，USA） ，12 孔、96 孔培养板（NUNC，丹麦） ，丝裂霉素（Sigma，USA） ，二甲基亚砜（DMSO，Sigma，USA） ，Bio-Red

9、550 型酶联免疫检测仪（日本）. 1.2 方法 人 RPE 细胞由西京医院眼科王雨生副教授惠赠4 的四种不同来源的人视网膜色素上皮细胞，第 46 代用于实验.复苏与培养方法同王琳等5 报告.增殖实验以含 100mLL-1 小牛血清的 DMEM 将细胞浓度调整为 2107 L-1 ，接种于 96 孔板（200L/孔） ，37，50mLL-1 CO2 的孵箱中过夜，吸弃旧培养液，分成两组:DMEM 和含 20mLL-1 小牛血清的DMEM（20gL-1 DMEM）.每组分别加入不同浓度的PDGF（0，0.1，1，10，50 和 100gL-1 ） ，每个浓度设 6 个复孔，培养 72h 后，加入

10、 MTT（20L/孔，5gL-1 ） ，继续培养4h，吸弃培养液，PBS 冲洗 2 次.加入 DMSO（150L/孔） ，振荡10min，490nm 波长测定其 A 值.实验重复 3 次.移行实验以100gL-1 DMEM 将细胞浓度调整为 1107 L-1 ，接种于 12 孔板（2mL/孔） ，37，50mLL-1 CO2 的孵箱中孵育至融合状态.加入 2gL-1 的丝裂霉素作用 1h.用剃须刀刮出一3mm3mm 的无细胞区，PBS 冲洗 3 次后，分为 DMEM 和 20gL-1 DMEM 组，分别加入不同浓度的 PDGF（0，0.1，1，10，50 和100gL-1 ） ，每个浓度设 3

11、 个复孔，观察 3d，每日计数进入缺损区的细胞数并测量其移行的距离.实验重复 3 次. 统计学处理:将实验数据应用 orign5.0 统计软件包进行统计学处理. 2 结果 2.1 增殖实验 PDGF（0.1100gL-1 ）能刺激人 RPE 的增殖.在 DMEM 组，10gL-1 的 PDGF 促增殖作用最显著，增殖率为 153%，20gL-1 DMEM 组，50100gL-1 的刺激作用最强达到 174%（Tab1）. 表 1 PDGF 对 hRPE 的增殖作用 略 2.2 移行实验 0.1100gL-1 的 PDGF 均能够促进 hRPE的移行，并呈剂量依赖性:100gL-1 时促移行能力

12、最强，DMEM组移行率为 510%，20gL-1 DMEM 组达 640%（Fig13）.缺损区周围的细胞由于部分细胞的移行，细胞密度降低，细胞间距增加，而进入缺损区的细胞呈纤维细胞样改变:胞体呈狭长形，细胞间连接减少，细胞间隙增加（Fig4） ，促移行作用呈剂量依赖性（Fig5）. 3 讨论 增生性玻璃体视网膜病变是孔源性视网膜脱离后的病理条件下 RPE细胞离开原位，由静止状态移行到玻璃体腔或脱离的视网膜表面，随后发生增殖并形成牵拉膜的一种过度损伤修复反应6 .在这一变化过程中，有多种细胞和细胞因子的参与，其中视网膜色素上皮细胞7 和血小板源性生长因子的分泌和调节失衡8 占有重要作用.近年来

13、研究发现它在 PVR 患者的玻璃体内和视网膜下液中有过量表达1 ，同时Robbins 等9 证实位于 PVR 增生膜边缘的 RPE 表达 PDGF 及 PDGF 受体强阳性.Andrews 等10 将表达 PDGFR 阴性的小鼠 RPE 注入兔玻璃体内不能诱发 PVR，而注入 PDGFR 阳性的 RPE 则诱导 PVR 成功，说明 PDGF 在PVR 的发病过程中起着关键性作用. 我们观察到 PDGF 在体外能够刺激人 RPE 的增殖和移行，培养液中含有血清时增强了这种作用，而且移行能力呈剂量依赖性，50100gL-1 时，DMEM 和 20gL-1 DMEM 组移行率分别为 510%和 64

14、0%，且随时间延长进入缺损区的细胞数目增多、距离增加，细胞形态呈成纤维细胞样.PDGF 的作用机制目前尚不清楚，可能 PDGF 和受体结合后，激活细胞内增殖、分裂、合成信号，从而启动细胞的有丝分裂和蛋白质合成11 .一些移行实验发现 PDGF 的促移行作用发生在因子刺激 10h 以后，其 mRNA 及蛋白质的合成增加，而 DNA 含量无明显变化.秋水仙素能明显抑制这种作用12 .也有报道 PDGF 作用 1h 即发生移行13 .我们的结果与前者一致，移形在 PDGF 加入 810h 后发生，因此推测 PDGF 的促移行作用与其促进蛋白质的合成有关.Verstraeten 等14 等通过观察纤维

15、粘连蛋白，肌动蛋白，微管蛋白的改变，以及波形蛋白的重新分布，提出 RPE 移行可能是通过改变细胞骨架完成的.由于PDGF 作用于细胞之后，使细胞处于“感受态” ，再在其他因子和蛋白质作用下达到“进展态” ，完成细胞的生命活动15 ，所以当有血清存在时，其促增殖和移行能力均有所增强. 图 1 图 5 略 研究发现 PDGF 在玻璃体内的半衰期非常短，但当其与血浆内 PDGF结合蛋白结合16 ，就可以延长其作用时间，发挥局部调节功能.因此，当眼内血-视网膜屏障破坏，血液中的一些成分（PDGF，FN 等）进入玻璃体腔，可能会促进和延长 PDGF 的作用效果，使 PVR 的发生率增加.PDGF 能够增

16、加 RPE 堆积胶原束的能力17 ，促进细胞性纤维膜的收缩18 .由于 PDGF 促增殖和移行的多重作用，联系 PVR 的病理变化过程:细胞移行-增殖-分泌细胞外基质-形成牵拉膜，可以看出 PDGF 在 PVR 的形成过程中发挥着重要作用.由此，PDGF 参与了 PVR 的全部发病过程.所以，如果能够抑制 PDGF 的作用，就可能为临床上防治 PVR 提供一种新的途径. 参考文献: 1Cassidy L，Barry P，Shaw C，Duffy J，Kennedy S.Platelet de-rived growth factor and fibroblast growth factor ba

17、sic levels in the vitreous of patiens with vitreoretinal disorders J.Br J Ophthalmol，1998;82（2）:181-185. 2Campochiaro PA，Hackett SF，Rinores SA，Freund J.Platelet-derived growth factor is an autocrine growth stimulatior in reti-nal pigmented epithelial cells J.J Cell Sci，1994;107（9）:2459-2469. 3Kawaha

18、ra RS，Deuel TF，Mustoe TA，Pierce AF.Growth fac-tors and wound healing:PDGF as a model cytokine J.Annu Rev Med，1991;42（）:567-584. 4Wang YS，Yan M.Visible light damage in the primary cultured human retinal pigment epithelial cells J.Zhonghua Yandibing Zazhi（Chin J Ocular Fundus Diseases） ，1996;12（3）:174

19、-176. 5Wang L，Hui YN，Wang YS，Hui HX，Tang CW.Cryopreser-vation of human retinal pigment epithelial cells and culture from thawing of frozen cells J.Zhonghua Yandibing Zazhi（Chin J Ocular Fundus Diseases） ，1997;13（3）:157-159. 6Hui YN.Proliferative vitreoretinopathy A.In:Yan M.Oph-thalmology M.4ed.Beij

20、ing:Health of Republic Inc，1998:104-106. 7Toti P，Greco G，Catella AM.Morphological and pathogenetic aspects of proliferative vitreoretinopathy.A histological and im-munohistochemical study J.Doc Ophthalmol，1994;88（2）:105-112. 8 Leschey KH，Hackett SF，Singer JH，Campochiaro PA.Growth factor responsivene

21、ss of human retinal pigment epithe-lial cells J.Invest Ophthalmol Vis Sci，1990;31（5）:839-846. 9Robbins SG，Mixon RN，Wilson DJ，Hart CE，Robertson JE，Westra I，Planck SR，Rosenbaum JT.Platelet derived growth factor ligands and receptors immunoloclized in proliferative reti-nal diseasea J.InvestOphthalmol

22、Vis Sci，1994;35（10）:3649-3663. 10Andrews A，Balciunaite E，Leong FL，Tsllquist M，Soriano P，Refojo M，Kazlauskas A.Platelet derived growth factor plays a key role in proliferative vitreoretinopathy J.InvestOphthalmol Vis Sci，1999;40（11）:2683-2689. 11Ek.B，Heldin CH.Use of an antiserum against phosphotyros

23、ine for the identification of phosphorylated components in human fi-broblasts stimulated by platelet-derived growth factor J.J Bi-ol Chem，1984;259（17）:11145-11152. 12Peter A，Campochiaro MD，Bert M，Glaser MD.Mechanisma involved in retinal pigment epithelial cell chemotaxis J.Arch Ophthalmol，1986;104（2

24、）:277-280. 13Velhagen KH，Druegg A，Rieck P.Proliferation and wound healing of retinal pigment epitheliun cells in vitro.Effect of hu-man thrombocyte concentrate，serum and PDGF J.Ophthal-mology，1999;96（2）:77-81. 14Verstraeten T，Hartzer M，Wilcox DK.Effects of vitamin A on retinal pigment epithelial cel

25、ls in vitro J.Invest Ophthalmol Vis Sci，1992;33（10）:2830-2838. 15Smith JC， Stiles CD.Cytoplamic transfer of the mitogenic re-sponse to platelet-derived growth factor J.Proc Natl Acad Sci USA，1981;78（7）:4363-4367. 16Raines EW， Bowen DF，Ross R.Plasma binding proteins for PDGF that inhibit its binding

26、to cell-surface receptors J.Proc Natl Acad Sci USA，1984;81:43424-3428. 17Carrington L，Mcleod D，Boultin M.IL-10and antibodies to TGF-beta2and PDGF inhibit RPE-mediated retinal contraction J.Invest Ophthalmol Vis Sci，2000;41（5）:1210-1216. 18Bert M，Glaser BM，Cardin A，Biscoe B.Proliferative vitreo-retinopathy the mechanism of development of vitreoretinal traction J.Ophthalmology，1987;94（4）:327-332.