转化生长因子β1 基因对骨髓基质干细胞增殖分化的影响 .doc

1、转化生长因子 1 基因对骨髓基质干细胞增殖分化的影响 作者：郑志宏 郭庆科 邹敬才 【关键词】 骨髓细胞 关键词: 转化生长因子 1 ;骨髓细胞;干细胞;转染 摘 要:目的 观察转化生长因子 1 （TGF-1 ）基因能否转入骨髓基质干细胞（MSCs） ，并探讨经 TGF-1 基因转染后的 MSCs 增殖和分化情况. 方法 取新西兰雄性大耳白兔的骨髓，得骨髓源 MSCs 体外培养.将重组 TGF-1 和空载 pcD-NA3 基因分别转染 MSCs 后，免疫组化（SABC）法检测 TGF- 1 转染是否成功，用透射电镜和流式细胞仪观察两组MSCs 的增殖和分化情况. 结果 SABC 法证明 TGF

2、- 1 瞬间转染成功;转染 48h 后，实验组 MSCs 增殖较对照组显著;实验组 MSCs 具有一定的分化趋势. 结论 重组 TGF- 1 基因转入骨髓源 MSCs 的方法是可行的，瞬间 TGF-1 转染对 MSCs 的增殖和分化有显著促进作用. Keywords:transforming growth factor1 ;bone marrow cells;stem cells;transfection Abstract:AIM To investigate whether transforming growth factor1 （TGF-1 ）gene can be successfull

3、y transfered into mesenchymal stem cells（MSCs）and if it can be，then to ob-serve the effect of the successful recombinant TGF-1 gene transfer on MSCs.METHODS Adult male New Zealand rabbits were used to collect MSCs.After the transfection of both recombinant TGF-1 and pcDNA3genes，the multiplica-tion a

4、nd differentiation of MSCs were observed by flowcy-tometry and transilluminating electron microscope and the positive expression of TGF-1 was detected by immunohis-tochemical staining（SABC）.RESULTS Transfer was suc-cessful with the evidence of SABC.There was significant multiplification in MSCs with

5、 TGF-1 transfer and the trend of the differentiation was obvious after transient transfection.CONCLUSION TGF-1 gene can be successfully transferred into MSCs.48hours after the transfection，the MSCs num-ber increased obviously and the differentiation of MSCs is sig-nificant. 0 引言 转化生长因子 1 （Transformi

6、ng growth factor1 ，TGF-1 ） ，具有促进种子细胞增殖分化等多重生物学效应，但外源性生长因子因其诸多不利特性和价格昂贵，不能发挥持续高效作用.我们通过将组织工程和分子生物学有机结合，将 TGF-1 基因转入骨髓基质干细胞（MSCs） ，探讨基因转染对 MSCs 增殖和分化的影响. 1 材料和方法 1.1 材料 取 46mo 龄新西兰雄性大耳白兔 1 只，2.0kg（第四军医大学动物中心提供）;DEME 培养液（Gibco）;胎牛血清（浙江金华清胡犊牛利用研究所）;胰蛋白酶（Sigma）;CO2 培养箱（美国 scien 公司）;倒置显微镜（olympus）;淋巴（Fico

7、ll）分离液（密度 1.077）;TGF-1 免疫组化试剂盒（购自博士德公司）;流式细胞仪（FCM）检测细胞周期，透射电镜（TEM）观察. 1.2 方法 1.2.1 MSCs 的分离培养 将新西兰大耳白兔于耳缘 iv250mL L-1 乌拉坦 2mL kg-1 麻醉致死.无菌条件下取股骨骨髓;Ficoll 分离液反复冲洗吹打，20min，2000r min-1 离心两次，取中间乳白色的有核细胞层;用 DEME 培养液洗涤，并吹打成细胞悬液;接种于 50mL 培养瓶内，加入pH7.3 的 DEME 培养基 5mL.置入 37，50mL L-1 CO2 孵育箱中孵育. 1.2.2 实验分组 将第

8、2 代 MSCs 接种 6 孔培养板中的 2 孔内，孔内均预置盖玻片 1 片，并同时传代于 6 瓶 50mL 培养瓶中.当细胞生长至70%80%融合时，按标准方法以 3L Lipofectamine 介导的 1L pcD-NA3-TGF-1 重组表达质粒转入 3 瓶细胞和 1 孔培养板中的 MSCs，为实验组.其余均为对照组，仅转入 1L pcDNA3 空载体. 1.2.3 TGF-1 基因转染的瞬时表达 48h 后取出两孔细胞爬片，SABC 法检测瞬时表达情况，各组用 1 瓶细胞在透射电镜下观察，其余两瓶细胞和培养板内细胞用流式细胞仪以 488nm 氩激光检测细胞周期.数据处理:实验数据以

9、x s 表示，组间比较用 t 检验. 2 结果 2.1 TGF1 基因转染瞬间表达 SABC 法显示转染 48h 后，大部分TGF-1 基因转染细胞浆内充满棕色颗粒，pcDNA3 空载体转染细胞对照组则为阴性（Fig1，2）. 2.2 TGF1 基因转染对 MSCs 增殖的影响 试验组 S 期细胞 DNA含量显著高于对照组，G0 /G1 期细胞 DNA 的含量相对减少（Tab1）. 表 1 转染后 48h MSCs 各细胞周期 DNA 含量比较 略 2.3 TGF1 基因转染对 MSCs 定向分化的影响 TGF-1 基因转染 MSCs 功能活跃，粗面内质网增多、扩大，胞质内有丰富的核糖体、脂滴

10、、线粒体和溶酶体及中等电子密度的无定形物，细胞核常染色质丰富，核仁清晰.空载体转染 MSCs 胞浆内亦有丰富的细胞器，但粗面内质网、核糖体明显少于实验组 MSCs（Fig3，4）. 图 1 图 4 略 3 讨论 许多组织中的间充质前体细胞的数量和增殖活性很高，具有向软骨分化的潜能.骨髓基质干细胞（MSCs）由于易于获取并能应用这些细胞在体内修复弱骨缺损而引起研究者们极大兴趣.但体外培养时 MSCs 的分化机制较为复杂，不同细胞因子和培养条件对其的影响不同，而 TGF-1 对 MSCs 向软骨细胞分化是必需的.TGF-1 生物活性及其广泛，能诱导多种间充质来源组织向软骨分化，如大鼠胚胎中的间充质

11、干细胞和骨膜衍生细胞等，其受体的大量表达能促进软骨细胞合成蛋白聚糖和胶原进而保持软骨细胞表型稳定.然而外源性生长因子的半衰期短，局部使用易被稀释，需反复给药，价格又十分昂贵.本实验结合了组织工程和分子生物学，将 TGF-1 基因转入 MSCs 中，通过 MSCs 自身分泌 TGF-1 来调节细胞生物学特性的方法，既可以避免外源性 TGF-1 不能发挥持续高效的作用，又可以减少实验中许多相关误差的产生.目前尚未见对骨髓来源的基质干细胞进行 TGF-1 基因转染的报道1 .本实验中经组织化学免疫染色证明 TGF-1 基因得到瞬间表达，预示用基因重组 TGF-1 经脂粒介导转染骨髓源性 MSCs 的

12、方法是可行的. MSCs 是一种异质细胞群，其中存在基质干细胞及处于不同分化阶段的前体细胞.基质干细胞产生向某一种或多种细胞系定向分化的前体细胞的分化过程为一连续过程，随着细胞分化的定向性增高，其自身复制能力和多向分化性相应地减低.有研究证明 Dex，bFGF 抑制向软骨细胞方向分化2 .国内有研究表明，单纯体外高密度传代培养条件下可促进MSCs 向软骨细胞分化3 .TGF-1 从两个方面影响软骨形成，一是促使间质细胞向软骨细胞分化5，6 ;另一方面是通过促使软骨细胞成熟来刺激软骨基质的合成7，8 ，增加软骨的形成.可见 TGF-1 既是丝裂素，又是很好的助形态发生因子9 .本实验中 TGF-

13、 1 基因转染后 48h 的骨髓基质细胞 S 期细胞 DNA 含量显著高于对照组，G0 /G1 期细胞 DNA 含量显著减少，说明 TGF-1 基因转染能促进停滞在 G0 /G 1 期的细胞进入 S 期，促进 MSCs 增殖;透射电镜观察 TGF-1 基因转染的 MSCs48h 时功能活跃，细胞浆内丰富的粗面内质网、脂滴和线粒体等，细胞核常染色质丰富，虽然这些现象不能明确其具体的分化趋势，但符合软骨细胞早期分化的特征. 参考文献: 1Feng Y，Cao GW，Zheng XQ.Testing of cell culture fluid by recombinant TGF-1 gene tr

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