1252紫外分光光度法快速测定小麦胚芽脂肪氧化酶活力.doc

1、1252 紫外分光光度法快速测定小麦胚芽脂肪氧化酶活力作者：徐斌 董英 胡庆松 余雅斌 刘筠钧【关键词】 紫外分光光度法 小麦胚芽 脂肪氧化酶活力1 引 言小麦胚芽(WG)中的脂肪氧化酶(LOX)能催化氧化 WG 中的亚油酸，使 WG 短期内酸败变质。为延长保质期，常采用加热处理钝化 LOX。为了最大限度地保护 WG 营养，加热温度和时间的选择尤为重要。而 LOX 活性的准确测定则是进行麦胚稳定化理论研究的基础。研究表明，底物溶液的透明度、反应缓冲体系 pH 、反应温度、底物及 Tween 浓度等因素均会影响测定结果。现有的测定方法的酶纯化过程繁琐。此外，不同来源的LOX 的最适 pH 和最适

2、温度有着较大差异，应根据原料类型进行选择。为此，建立了一种改良的 WG 中 LOX 的检测方法，简单快速获得了透明的底物溶液，省去了粗酶液纯化的繁杂步骤。2 实验部分2.1 仪器与试剂 DU800 核酸蛋白分析仪(Beckman 公司);BR4 冷冻离心机(Jouan 公司);pHS3B 精密酸度计(上海雷磁仪器厂)。小麦胚芽(江南面粉公司);亚油酸标准品(Fluka 公司);其它试剂均为分析纯。2.2 样品制备 取 10 g 小麦胚芽，粉碎，加入 100 mL 0.1 mol/L醋酸盐缓冲液(pH 4.5)，4 下搅拌 30 min，悬浮液 12000 r/min 离心30 min，获得酶提

3、取液。用醋酸盐缓冲液稀释 10 倍，作为酶测定液。2.3 底物的配制 取 111 L 亚油酸，无水乙醇定容到 10 mL，取3.55 mL，加入 40 L Tween20 。减压蒸去乙醇，残余物溶解在 50 mL 0.05 mol/L Na2HPO4 溶液中，1 mol/L NaOH 调 pH 至 9.0。底物中亚油酸浓度为 2.53 mmol/L。2.4 酶活的测定 检测波长 234 nm，温度 25 ;反应液：2.0 mL缓冲溶液，200 L 底物溶液，50 L 粗酶液;参比液：2.0 mL 缓冲溶液，200 L 底物溶液，50 L 钝化处理的粗酶液。【关键词】 紫外分光光度法 小麦胚芽

4、脂肪氧化酶活力1 引 言小麦胚芽(WG)中的脂肪氧化酶(LOX)能催化氧化 WG 中的亚油酸，使 WG 短期内酸败变质。为延长保质期，常采用加热处理钝化 LOX。为了最大限度地保护 WG 营养，加热温度和时间的选择尤为重要。而 LOX 活性的准确测定则是进行麦胚稳定化理论研究的基础。研究表明，底物溶液的透明度、反应缓冲体系 pH 、反应温度、底物及 Tween 浓度等因素均会影响测定结果。现有的测定方法的酶纯化过程繁琐。此外，不同来源的LOX 的最适 pH 和最适温度有着较大差异，应根据原料类型进行选择。为此，建立了一种改良的 WG 中 LOX 的检测方法，简单快速获得了透明的底物溶液，省去了

5、粗酶液纯化的繁杂步骤。2 实验部分2.1 仪器与试剂 DU800 核酸蛋白分析仪(Beckman 公司);BR4 冷冻离心机(Jouan 公司);pHS3B 精密酸度计(上海雷磁仪器厂)。小麦胚芽(江南面粉公司);亚油酸标准品(Fluka 公司);其它试剂均为分析纯。2.2 样品制备 取 10 g 小麦胚芽，粉碎，加入 100 mL 0.1 mol/L醋酸盐缓冲液(pH 4.5)，4 下搅拌 30 min，悬浮液 12000 r/min 离心30 min，获得酶提取液。用醋酸盐缓冲液稀释 10 倍，作为酶测定液。2.3 底物的配制 取 111 L 亚油酸，无水乙醇定容到 10 mL，取3.55

6、 mL，加入 40 L Tween20 。减压蒸去乙醇，残余物溶解在 50 mL 0.05 mol/L Na2HPO4 溶液中，1 mol/L NaOH 调 pH 至 9.0。底物中亚油酸浓度为 2.53 mmol/L。2.4 酶活的测定 检测波长 234 nm，温度 25 ;反应液：2.0 mL缓冲溶液，200 L 底物溶液，50 L 粗酶液;参比液：2.0 mL 缓冲溶液，200 L 底物溶液，50 L 钝化处理的粗酶液。3 结果与讨论3.1 底物在不同 pH 条件下的稳定性 底物溶液分别用 pH 4.59.0的缓冲溶液稀释 10 倍，随着时间的延长，由于亚油酸在酸性条件下溶解度下降，产生

7、浑浊，由于光散射导致吸光度增大。pH 值越低，吸光度变化速度越快;pH 4.5 时达 0.19%。而 pH 8.0 和 9.0 的底物溶液比较稳定，吸光度在 2 h 内基本保持不变。选择 pH 7.0 缓冲液稀释底物，每隔 15 min 测定粗酶液酶活一次。由于亚油酸溶解度的下降，参与催化反应的底物量减少，导致同样的酶液 LOX 酶活力 2 h 后测定值仅为初始值的 69%。为此，本实验采用亚油酸Tween 无水乙醇混合体系配制反应底物，使亚油酸完全溶解在 Tween 中，再通过滴加 NaOH，能方便地获得透明的底物溶液。酶活测定时，在反应体系首先加入底物和所需 pH 值的缓冲液，稳定 5 m

8、in，再加入待测酶液，能有效消除在中性和酸性缓冲体系下，亚油酸溶解度下降产生的误差。3.2 底物浓度的优化 将不同浓度(0.3115 mmol/L)的底物溶液，用 pH 7.0 缓冲溶液稀释 10 倍，进行全波长扫描。随着底物亚油酸浓度的增加， 234 nm 处吸光度逐渐上升; 当底物浓度大于 5.0 mmol/L 时，溶液的吸光度为 0.77，如再加入酶液，反应体系的吸光度很快上升到2.0，将产生较大误差。底物浓度小于 2.5 mmol/L，溶液的初始吸光度则低于 0.23。酶活测定时，反应体系吸光度 3 min 内上升到 1.23，符合分光光度分析吸光度在 0.11.0 时线性关系最佳的要

9、求。当底物浓度小于6.2510-4 mol/L，由于亚油酸浓度过低，线性关系差。亚油酸的适合浓度范围为 1.252.50 mmol/L。3.3 Tween 浓度的影响 配制 3 种含不同浓度 Tween20 的底物溶液(亚油酸浓度均为 2.53 mmol/L)，测定酶活。结果表明，Tween20 有效增加了亚油酸在缓冲溶液中的溶解度，特别是在 pH8 的碱性条件下。然而随着底物溶液中 Tween20 浓度增加到 0.24%，Tween 开始对LOX 产生竞争抑制。Tween 的合适浓度范围为 0.08%0.16%。3.4 pH 的影响 LOX 在 pH 4.58.5 范围，均具有较高活力，最适

10、pH 为 6.5。当 pH9.0 时酶活力开始减弱。综合 3.1 中 pH 对底物稳定性的影响，最适 pH 范围为 6.57.5。在 pH 7.0 下，RSD=7.2%(n=8)。3.5 温度的影响 在 045 ,提高温度能显著增强 LOX 的活力; 随着温度进一步升高，活力开始下降，超过 55 时活力迅速下降，至65 完全失活。综合考虑，反应温度选择 2535 。在 25 下，RSD=5.3%(n=8)。3.6 方法线性范围、回收率及精密度 粗酶液中蛋白值含量为122.5 mg/L。在粗酶液添加量 570 L 范围内对 LOX 酶活进行分析，得到线性方程 A234/min=0.0053V-0.0075(A234/min 为每分钟吸光度的变化;V 为加酶量，L)，r=0.9984。添加 20 L 粗酶液，添加回收率为 88.3%，RSD=6.9%(n=8)。