HPLC-ELSD法测定银杏叶提取物及其制剂中 银杏内酯A、B、C和白果内酯含量.doc

1、HPLC-ELSD 法测定银杏叶提取物及其制剂中 银杏内酯 A、B、C 和白果内酯含量作者：冯建忠，高媛媛，汤道权，刘燕，王建，钱宇锦 【摘要】 目的 建立 HPLC-ELSD法测定银杏叶提取物（extract of Ginkgo biloba，EGb）及其制剂中银杏内酯 A、B、C 及白果内酯含量。方法 以 Kromasil C18为固定相，甲醇-四氢呋喃-水（12475）为流动相，流速 0.8 ml/min；柱温：35；蒸发光散射检测器蒸发温度为100，气体流速为 2.5 L/min。结果 银杏内酯 A、B、C、白果内酯的定量限分别为 0.106、0.104、0.105、0.105 mg/

2、ml，银杏内酯 A、B、C、白果内酯分别在0.1270.506、0.1290.548、0.1310.576、0.1310.561 mg/ml 浓度范围内其峰面积与浓度的线性关系良好（r0.999） ，方法回收率为92.4% 100.8%，日内精密度及日间精密度的变异系数分别小于2%、3%。结论 HPLC-ELSD法简单、准确，为银杏叶提取物中内酯类成分的质量控制提供了依据。 【关键词】 高效液相色谱 蒸发光散射检测器 银杏叶提取物 含量测定 Abstract： Objective To establish a high performance liquid chromatography (HP

3、LC) with evaporative light-scattering detector (ELSD) to determine the content of ginkgolide A, B, C and bilobalide in the extract of Ginkgo biloba (EGb) leaves and its pharmaceutical agents. Methods Kromasil C18 was designated as the stationary phase and methanol to tetrahydrofuran to water (12475)

4、 as the mobile phase; with the column temperature (250mm 4.6mm, 5m) of 35 at a flow rate of 0.8 ml/min, the evaporation temperature of 100 and the flow rate of gas of 2.5 L/min. Results The limits of quantitation for ginkgolide A, B, C and bilobalide were 0.106, 0.104, 0.105 and 0.105 mg/ml, respect

5、ively. This method is linear over concentration ranges of 0.127 0.506, 0.129 0.548, 0.131 0.576 and 0.131 0.561 mg/ml for ginkoglide A, B, C and bilobalide, respectively (r0.999). The recoveries for ginkgolide A, B, C and bilobalide were 92.4%100.8%. The coefficient of variation of intraday and inte

6、rday precision was respectively less than 2% and 3% for all compounds. Conclusion The validated method is accurate and easy to handle, thus providing the basis for the quality control of EGb. Key words: HPLC; ELSD; extract of Ginkgo biloba leaves; determination 银杏叶为银杏科植物银杏（Ginkgo biloba L.）的干燥叶，其提取物

7、是经现代提取工艺从银杏叶中提取的活性物质，其主要活性化学成分为两大类：黄酮类及萜类1 。银杏内酯是二萜类和倍半萜类内酯,二萜类内酯主要有银杏内酯 A 、B 、C 、J、M 等,倍半萜类内酯有白果内酯2 。自 20 世纪 70 年代初发现了 PAF 后,药理学家对银杏内酯进行了研究,证明银杏萜内酯是强血小板活化因子拮抗剂3 ,对免疫系统4 、中枢神经系统、缺血损伤有保护作用，并有抗休克、抗过敏及抗炎作用5 。国内外的药理学家对银杏内酯的药理作用及临床应用进行了大量的研究,银杏叶制剂在临床的应用也愈加广泛。 有关银杏内酯的体外检测方法很多,由于银杏内酯的低紫外吸收，同时存在的黄酮类物质有较强的干扰

8、，不便使用紫外检测器6-7 ，质谱检测器由于其灵敏度高，不受化合物紫外吸收的限制，目前已成为银杏内酯体内外测定的主要检测器8-12 ，但由于其价格昂贵，限制了其使用。蒸发光散射检测器由于其灵敏度及选择性均较好，因此常常作为银杏内酯类成分测定的首选13 ，我国药典14即采用高效液相色谱结合蒸发光散射检测器对银杏叶提取物中内酯类成分进行质量控制。 本实验采用高效液相色谱结合蒸发光散射检测器同时测定银杏叶提取物及其制剂中 4种内酯类化合物银杏内酯 A、B、C 以及白果内酯的含量。 1 仪器与试药 1.1 仪器 Shimadzu LC-10A高效液相色谱仪（日本岛津制作所） ，包括 SCL-10Avp

9、 System Controller， LC-10ADvp泵，FCV-10ALvp 四元低压梯度洗脱系统，DGU-20A5 在线脱气机，7725i 进样器；HW2000 色谱数据工作站(南京千谱软件科技有限公司)；蒸发光散射检测器（ELSD-UM3000，上海通微科技有限公司） 。自动双重纯水蒸馏器(型号 SZ-93，上海亚荣生化仪器厂)，Ultrasonic Generator (型号 H66MC，无锡超声电子设备有限公司)，梅特勒托利多 AE240电子天平(十万分之一，瑞士Mettler Toledo)。 1.2 试药 甲醇（色谱纯，美国 Fisher Scientific 公司） ，四氢

10、呋喃（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司） ，水为双蒸水，其余试剂为分析纯。对照品银杏叶提取物（110866-200202） 、银杏内酯 A(100080-200306)、银杏内酯 B(100081-200406)、银杏内酯 C(110861-200606)、白果内酯(110860-200407)，均购自中国药品生物制品检定所。样品 EGb A（20060725） 、EGb B（20070213） 、EGb C（20061278） 、EGb D、舒血宁注射液分别购自徐州 EH药业公司、浙江 KEB药业公司、江苏 YZJ药业公司、邳州 FW生物科技有限公司、黑龙江珍宝岛制药有限公司。 2 方法与结

11、果 2.1 色谱条件 色谱柱为 Kromasil C18（大连依利特有限公司，250 mm4.6 mm，5 m） ，柱温：35，进样量：20L，流速 0.8 ml/min；蒸发光散射检测条件：蒸发温度 100，气体流量 2.5 L/min；流动相为甲醇-四氢呋喃-水（12475） 。在此条件下银杏内酯A、B、C 及白果内酯的保留时间分别为 27、40、21、29min。色谱图见图1。 图 1 对照品 HPLC-ELSD色谱图 1.银杏内酯 C ；2.银杏内酯；3.白果内酯；4.银杏内酯 B 2.3 样品溶液的制备 取银杏叶提取物 30 mg，精密称定，加水 2 ml，置水浴中温热使溶散，加 2

12、%盐酸溶液 1滴，用乙酸乙酯振摇提取 4次（3 ml，2 ml，2 ml，2 ml） ，合并提取液，用 5%醋酸钠溶液 4 ml洗涤，分取醋酸钠液，再用乙酸乙酯 2 ml洗涤。合并乙酸乙酯提取液及洗液，用水洗涤 2次，每次 4 ml，分取水液，用乙酸乙酯 2 ml洗涤，合并乙酸乙酯液，回收溶剂至干，残渣用甲醇溶解并转移至 2 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。 2.4 标准贮备液的配制 精密称取银杏内酯 A、B、C、白果内酯对照品适量，用甲醇溶解并定容至 5 ml棕色容量瓶中，摇匀即得含银杏内酯 A 1.012 mg/ml、银杏内酯 B 1.096 mg/ml、银杏内酯 C

13、 1.152 mg/ml、白果内酯 1.122 mg/ml的混合对照品标准贮备液，4保存，备用。 2.5 方法学考察 2.5.1 线性关系 精密量取“2.4”项下混合对照品标准贮备液1、0.6、0.5、0.4、0.25、0.2、0.16 ml，用甲醇-四氢呋喃-水溶液（12475）分别稀释并定容至 2 ml，得 7个浓度的混合对照品溶液。按已建立的色谱条件，取各浓度对照品溶液分别进样 20 l 分析，每个浓度点分别在实验开始、实验中间、实验结束时各进样 1次，以浓度（x，mg/ml）对峰面积平均值（y）回归，得回归方程。结果表明，浓度与峰面积之间呈良好的线性关系。见表 1。表 1 线性关系实验

14、结果 2.5.2 检测限和定量限 取“2.4”项下混合对照品标准贮备液，用甲醇-四氢呋喃-水溶液（12475）依次稀释制成一系列由高到低的梯度浓度溶液并进样分析，测定峰面积约为噪音 10倍（S/N10）时的进样浓度为定量限（QOD） ，测定峰面积约为噪音 3倍（S/N3）时的进样浓度为检测限（LOD） ，结果银杏内酯 A、B、C、白果内酯的定量限分别为 0.106、0.104、0.105、0.105 mg/ml，检测限分别为0.063、0.069、0.072、0.07 mg/ml。 2.5.3 回收率考察 精密称取已知含量的 EGb A（批号：20060725）30 mg，分别加入“2.4”项

15、下混合对照品标准贮备液80、100、120 l（每个水平取样 3份） ，按“2.3”项下样品处理方法进行处理，在“2.2”项色谱条件下进样分析，得 4个成分 3个浓度回收率的平均值及 RSD（见表 2） 。表 2 回收率实验结果 2.5.4 精密度考察 取 EGbA，按“2.3”项制备供试品溶液，取该供试品溶液 20 l 在“2.2”项色谱条件下连续进样 6次，以峰面积计算，4 个成分日内精密度（RSD）分别为 1.5%、1.2%、1.1%、1.9%。取该供试品溶液 20 l 在“2.2”项色谱条件下连续分析 6天，每天进样 1次，以峰面积计算，4 个成分日间精密度（RSD）分别为2.2%、2

16、.3%、2.5%、2.1%。 2.5.5 重现性和稳定性考察 取 EGb A样品 6份，按“2.3”项下制备供试溶液并在“2.2”项下色谱条件进行分析，4 个内酯类成分色谱峰面积的 RSD结果见表 3。表 3 重现性和稳定性实验结果 取 EGb A的供试品溶液 1份，室温下自然放置，分别在0、1、3、5、7、10 h取 20 l 在“2.2”项下色谱条件进行分析，计算四个内酯类成分色谱峰面积的 RSD，结果见表 3。 2.6 实际样品的测定 取银杏叶提取物，按“2.3”项制备供试品溶液，在“2.2”项下色谱条件进样 20 l 分析，根据回归方程计算四个内酯类成分的含量，结果见表 4。银杏叶提取

17、物样品色谱图见图 3。表4 银杏叶提取物中 4种内酯类化合物含量测定结果 3 讨 论 中国药典规定银杏叶提取物中内酯类含量的控制是将银杏内酯A、B、C 及白果内酯的含量加和计算成总内酯的含量，并规定总内酯含量必须在 6.0%以上，由实验结果可以看出各厂家生产的银杏叶提取物均符合药典标准，但徐州 EH样品未检出银杏内酯 C，舒血宁注射液未检出白果内酯。据文献报道银杏内酯 C具有抑制血小板聚集因子，白果内酯具有神经保护作用，可见用总内酯含量并不能全面控制银杏叶提取物及其制剂的质量，因此，如何全面控制银杏叶提取物及其制剂的质量仍需进一步研究。 【参考文献】 1 Van Beek TA. Chemic

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