IL1β对成纤维细胞合成Ⅰ型胶原蛋白作用及机制.doc

1、IL1 对成纤维细胞合成型胶原蛋白作用及机制作者：李学森 褚言琛 邹云雯 王志杰 【摘要】 目的 研究白细胞介素 1 (IL1) 对成纤维细胞合成型胶原蛋白的作用及机制，以探讨 IL1 对硬膜外瘢痕形成的影响。方法 将 NIH3T3 细胞随机分为 IL1 组、IL1+SB202190(p38 MAPK特异性阻断剂)组和对照组,各组经无血清培养 20 h 后，IL1 组加入10 g/L 的 IL1 ，IL1+SB202190 组用 10 mol/L 的 SB202190预作用 1 h 后加入 10 g/L 的 IL1 ，对照组直接加体积分数 0.02 的血清。各组培养 24 h 后收集细胞，采用

2、 RTPCR 法检测型胶原 2 基因(COL1A2)mRNA 的表达，Western blotting 法检测 COL1A2 蛋白的表达。结果 IL1 组 COL1A2 mRNA 和 COL1A2 蛋白表达均明显低于IL1+SB202190 组和对照组，差异有显著性(F=55.67、251.01,q=11.8828.79,P0.01);IL1+SB202190 组低于对照组，但差异无显著性(q=1.88、2.93,P0.05)。结论 IL1可能通过抑制 NIH3T3 细胞 COL1A2 的合成而抑制硬膜外瘢痕的形成，p38信号通路在 IL1 抑制瘢痕形成过程中起到重要的作用。 【关键词】 白细

3、胞介素 1;p38 信号通路;硬膜外隙;瘢痕;成纤维细胞;胶原蛋白 ABSTRACT Objective To investigate the role and mechanism of interleukin1 in the synthesis of type collagen by fibroblast so as to explore the impact of interleukin1 on the formation of epidural scar. Methods The NIH3T3 cells were divided into three groups: IL1 group

4、, IL1 + SB202190 (specific p38 MAPK blocker) group and control group. After serumfree culturing for 20 hours, 10 g/L of IL1 was added to IL1 group. The IL1 + SB202190 group was treated with SB202190 (10 mol/L) for 1 hour before adding IL1 (10 g/L), and the control group received same volume of 2% se

5、rum. After culturing for another 24 hours, cells were collected, and both mRNA and protein expressions of type collagen A2 (COL1A2) detected with RTPCR and Western blotting, respectively. Results The mRNA and protein expressions of COL1A2 in IL1 group were significantly lower than that of the IL1 +

6、SB202190 group and the control group (F=55.67, 251.01;q=11.88-28.79;P0.01). The expressions of COL1A2 mRNA and protein in IL1 + SB202190 group were lower than that of the control group, but the difference was not significant (q=1.88,2.93;P0.05). Conclusion IL1 might inhibit the formation of epidural

7、 scar by inhibiting the expression of COL1A2 in NIH3T3 cells, and p38 signaling pathway may play an important role in the process of scar formation. KEY WORDS interleukin1; p38 mitogenactivated protein kinase; cicatrix; epidural space; fibroblasts; collagen 硬膜外瘢痕是腰椎手术失败综合征(FBSS)的重要原因之一，约占FBSS 的 5%24

8、%12 。对硬膜外瘢痕的防治长期以来缺少有效措施,而目前最前沿的细胞因子疗法对瘢痕的治疗取得了较好效果34 。白细胞介素 1(IL1) 是一类重要的前炎症因子,在体内的组织损伤修复过程中起到重要的作用。p38 MAPK 信号通路是目前丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)通路中的一个重要成员,参与细胞对许多外界刺激的调节反应56 。本研究应用 IL1 以及 p38 MAPK 的特异性阻断剂(SB202190)作用 NIH3T3 细胞，从胶原基因的转录水平调控及蛋白水平调控来研究IL1 在纤维化过程中的作用及其机制，以期为硬膜外瘢痕的防治提供理论依据。现将结果报告如下。 1 材料与方法 1.1 实验试

9、剂 NIH3T3 小鼠胚成纤维细胞(中国科学院上海细胞库)，胎牛血清(杭州四季青公司)，DMEM 高糖培养基和 2.5 g/L 胰蛋白酶(Gibco 公司)，小鼠IL1(PeproTech 公司),p38 MAPK 特异性阻断剂 SB202190(Sigma 公司)，RIPA 裂解液(碧云天生物技术有限公司),以型胶原 2 基因(COL1A2)兔多克隆抗体和 actin 鼠单克隆抗体(Santa Cruz 公司)为一抗,辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠 IgG 和山羊抗兔 IgG(Santa Cruzs 公司)为二抗, Trizol RNA 提取液和 RTPCR 试剂盒(大连宝生物工程有限公司)

10、,小鼠 COL1A2 mRNA 及内参照(GAPDH)的 PCR 引物(上海生工生物工程技术服务有限公司)，化学发光剂(北京全式金生物技术有限公司),4上样缓冲液(Solarbio 公司)。 1.2 实验分组与处理 NIH3T3 细胞在含体积分数 0.10 胎牛血清的 DMEM 高糖培养基中常规培养,选择对数生长期的 NIH3T3 细胞，用 2.5 g/L 的胰酶消化成单细胞悬液，按约 0.5108/L 的密度以均等的细胞数分别分装到 3 个 25 cm2培养瓶中，于 37 、体积分数 0.05 CO2 培养箱中培养，待融合达70%80%时,随机分为 IL1 组、SB202190+IL1 组及

11、对照组，各组经无血清 DMEM 培养 20 h 后，更换培养液。IL1 组加入浓度 10 g/L 的 IL1;IL1+SB202190 组用 10 mol/L 的 SB202190 预作用 1 h 后更换培养液,加入浓度 10 g/L 的 IL1; 对照组直接加含体积分数 0.02 胎牛血清的培养基。经上述换液后,继续培养 24 h，收集细胞。 1.3 检测指标及方法 1.3.1 COL1A2 mRNA 表达的检测 应用逆转录 聚合酶链反应(RTPCR) 法。细胞培养 24 h 后，按照 Trizol 细胞裂解液说明提取细胞总 RNA，所获样品总 RNA 的 A260/A280 比值为 1.8

12、2.0。取 2 g 总 RNA按照逆转录试剂盒说明书方法行逆转录反应,合成 cDNA,随后进行 PCR 扩增。引物设计应用 Primier 5.0 软件，计算机完成。PCR 引物序列:小鼠 COL1A2:上游引物 5CTCTGTCCTAGTCGATGGCTGC3, 下游引物5ACGGAATTCTTGGTCAGCACC3, 扩增片段长为 142 bp;GAPDH:上游引物 5GCATTGTGGAAGGGCTCA3, 下游引物5GGGTAGGAACACGGAAGG3, 扩增片段长 207 bp。扩增条件:94 预变性 5 min;然后 94 变性 30 s、57 退火 30 s、72 延伸 45

13、s,共扩增 35 个循环;最后 72 延伸 10 min。PCR 产物行溴乙锭染色的0.02 g/L 琼脂糖凝胶电泳,用 UVP 凝胶分析系统扫描、分析电泳带的灰度,以COL1A2 扩增条带灰度与扩增 GAPDH 条带灰度之比表示 COL1A2 mRNA 表达水平。 1.3.2 COL1A2 蛋白表达的检测 采用 Western blotting 法。细胞培养 24 h 后,采用 RIPA 裂解液 (400 L RIPA+4 L PMSF)裂解细胞提取细胞总蛋白，取 50 g 蛋白上样行 100 g/L SDSPAGE 电泳、转膜、封闭。分别使用 COL1A2 兔多克隆抗体(1200)和 ac

14、tin 鼠单克隆抗体(1500)孵育,室温轻摇 2 h 后，4 过夜,再用 TBS 洗涤 3 次(每次 10 min),分别用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔 IgG(15 000)和山羊抗小鼠 IgG(15 000)室温孵育 120 min,TBS 洗涤 3 次(每次 15 min)后,最后X 线片曝光、显影和定影后观察结果。 1.4 统计学处理 应用 SPSS 13.0 和 PPMS 1.57统计学软件进行数据处理，结果以s 表示，各组间比较应用方差分析。P0.05 为差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 各组 COL1A2 mRNA 表达的比较 IL1 组 COL1A2 mRNA 的表达明

15、显低于 IL1+SB202190 组和对照组，差异均有显著性(F=55.67,q=11.8813.76,P0.01),IL1+SB202190 组表达虽低于对照组，但差异无显著性(q=1.88,P0.05)。见图 1 和表 1。 2.2 各组 COL1A2 蛋白表达的比较 IL1 组 COL1A2 蛋白表达明显低于 IL1+SB202190 组和对照组，差异有显著性(F=251.01，q=25.8628.79,P0.01);IL1+SB202190 组 COL1A2 蛋白表达虽低于对照组，但差异无显著性(q=2.93,P0.05)。见图 2 和表 1。 3 讨 论 硬膜外瘢痕又称硬膜外纤维化,

16、是指在硬膜外隙的手术涉及范围内形成的瘢痕或组织纤维化,是机体对创伤的修复反应,每例腰椎手术后病人都会发生。瘢痕的粘连收缩会牵拉硬膜和神经根,限制其活动;被瘢痕包绕的神经根受到非正常的牵拉和挤压,神经纤维的轴浆运输、动脉血供、静脉回流受影响,神经根和背侧神经节对机械压迫很敏感,会产生一系列症状,如疼痛、麻木、下肢肌力降低等。 在纤维化疾病中，异常沉积在组织器官的细胞外基质以胶原为主，尤其是型胶原等纤维性胶原，最终使组织器官硬化导致功能障碍或丧失，因此，对胶原的调控显得尤为重要。而最近有文献报道，IL 对照组，IL1 组，IL1+SB202190 组，、分别为、的 GAPDH 内参。 图 1 RT

17、PCR 检测靶细胞中 COL1A2 mRNA 的表达 对照组，IL1 组，IL1+SB202190 组。 图 2 Western blotting 检测靶细胞 COL1A2 蛋白的表达表 1 各组细胞 COL1A2 mRNA 和蛋白表达 1 可以抑制肌腱成纤维细胞胶原的表达8，提示 IL1 可能对瘢痕的形成有作用。然而，IL1 对纤维化疾病作用的研究报道较少。本文通过观察 IL1 对 NIH3T3 细胞 COL1A2 mRNA和蛋白表达的影响，来研究 IL1 对瘢痕的作用。IL1 是一种具有多种生物活性的炎症细胞因子,能调节局部和系统的炎症反应,在组织损伤的修复过程中发挥着重要作用。而 NIH

18、3T3 细胞是常被用作抗纤维化药物的筛选和机制研究的成纤维细胞系。本文的实验结果显示，一定浓度的 IL1 能够抑制成纤维细胞 COL1A2 的合成。而 COL1A2 合成的减少，在一定程度上可以使组织纤维化的机会减少。由此可以推测，IL1 在纤维化疾病过程中通过抑制成纤维细胞胶原蛋白的合成，一定程度上可以减少胶原的异常沉积，从而抑制瘢痕的形成。然而，还有文献报道，IL1 能促进大鼠心肌成纤维细胞基质金属蛋白酶(MMPs)表达8，而MMPs 可以降解胶原蛋白等细胞外基质，在组织重构方面起重要的作用。所以，IL1 在抑制瘢痕形成方面是否有更强大的作用还有待进一步的研究。 对于 IL1 如何调节成纤

19、维细胞胶原合成的研究报道尚少。目前，有文献报道，在 p38 通路 IL1 调整大鼠心肌成纤维细胞 MMPs 表达中起重要作用9。而 p38 通路可被应激刺激(紫外线、H2O2、热休克和低氧等)、炎性因子(TNF 、IL1 和 IL6 等)及 LPS 和革兰阳性细菌细胞壁成分激活，参与炎症、应激等许多病理生理反应。本文的研究结果表明,应用 p38 MAPK 激酶阻断剂 SB202190(浓度为 10 mol/L)处理细胞后，可明显减弱 IL1 对成纤维细胞 COL1A2 mRNA 及蛋白表达的作用。说明 p38 通路在 IL1 抑制成纤维细胞 COL1A2 表达的过程中起了重要的作用。 综上所述

20、, IL1 能抑制成纤维细胞型胶原 mRNA 的表达和蛋白的合成,减少胶原的合成，使胶原异常沉积的机会减少，从而对瘢痕的形成起到一定的抑制作用。而 p38 信号通路作为重要信号转导途径之一，在预防瘢痕形成、调节纤维化的过程中发挥重要作用。 【参考文献】 1COKLUK C, AYDI K. Experimental rabbit hemilaminotomy model in the evaluation of peridural fibrosis: a minimally invasive peridural fibrosis modelJ. Minim Invasive Neurosurg

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