N，N－二(2-氯乙基)芥酸酰胺的合成及其抗肿瘤作用的研.doc

1、N，N二(2-氯乙基)芥酸酰胺的合成及其抗肿瘤作用的研作者：秦箐，高明星，莫德欢，王闻楚，林华，邝晓聪 【摘要】 目的首次合成未见报道的 N，N-二(2-氯乙基)芥酸酰胺，探讨其体内外抗肿瘤活性。方法以芥酸和双(2-氯乙基)胺盐酸盐为原料、吡啶为催化剂合成 N，N-二(2-氯乙基)芥酸酰胺，分离纯化后核磁共振谱确证结构；用 N，N-二(2-氯乙基)芥酸酰胺作用于 Tca8113，用倒置显微镜镜下观察其对 Tca8113 细胞的生长状况的影响，PI 染色经流式细胞术分析其杀伤效应；S180 小鼠动物肿瘤模型观察 N，N-二(2-氯乙基)芥酸酰胺对肿瘤的体内抑制作用。结果合成出了 N，N-二(2-

2、氯乙基)芥酸酰胺并确证了其结构；N，N-二(2-氯乙基)芥酸酰胺于体外0.1510.0 g/ml 的浓度范围对 Tca8113 有较强的杀伤效应，杀伤率均超过 30%，但与浓度递增无明显的正相关，在 100.0 g/ml 以上的浓度反而杀伤效果不佳；体内抑制 S180 的生长，剂量为 5 mg/kg 时，抑制作用最好，生命延长率为 38.20，体重平均增长速率为 2.45%。结论采用微型合成法能够快速、方便地合成出 N，N二 【关键词】 芥酸； N，N-二(2-氯乙基)芥酸酰胺； Tca8113； S180； 抗肿瘤作Abstract：ObjectiveTo study the synthes

3、is of the N,N-di(2-chloroethyl)erucamide and its activity of anti-tumor in vitro and vivo. MethodsThrough the micro-organic synthesis technology, erucic acid was coupled with N,N-di(2-chloroethyl)amine hydro-chloride as starting materials, pyridine as catalyst to synthesize the N,N-di(2-chloroethyl)

4、erucamide. Isolation and purification were achieved by silical gel column chromatography, and its structure was confirmed by nuclear magnetic resonance spectrum.Tca8113 was cultured in media with N,N-di(2-chloroethyl)erucamide,and the cell growth was observed through inverted microscope. The anti-tu

5、mor effect was detected by flow cytometry. Investigate the growth inhibitory for murine tumormodels in vivo.ResultsThe N,N-di(2-chloroethyl)erucamide was synthesized successfully and its strong killing effect was recorded within 0.15g/ml10.0g/ml in vitro, and the rate was beyond 30%, but the effect

6、had no positive correlation with concentration. The inhibitory concentration 50 % (IC50) was 0.135 38g/ml . This compound had significant inhibitory effect on S180 growth in vivo. As dose was 5mg/kg, the inhibitory effect was the best, the life-prolonging rate was 38.20,the average growth rate of bo

7、dy weight was 2.45%. ConclusionThrough the microscale organic synthesis, N,N-di(2-chloroethyl)erucamide can be synthesized quickly and conveniently. N,N-di(2-chloroethyl)erucamide has obvious anti-tumor effect in vitro and in vivo.Key words： Erucic acid; N,N-di(2-chloroethyl)erucamide; Tca8113; S180

8、; Anti- tumor为了研究药物的构效关系，我们需合成一系列的高级不饱和脂肪酸类似物，N，N-二(2-氯乙基)芥酸酰胺是其中之一。本文选取芥酸为原料，采用经典的酰化反应，使用微型有机合成技术，首次合成出了目标产物。国内外学者从机制、临床意义等多方面对氮芥类药物抗肿瘤进行了大量的研究，目前临床上使用的氮芥类抗肿瘤药物有环磷酰胺、苯丁酸氮芥等1 。而大多数抗肿瘤药物在有效剂量范围内的毒性比较大，有肾毒性、免疫抑制等不良反应。为了征服癌症，延长癌症病人的生存时间和提高生活质量，寻找低毒、高效、构效明确的抗肿瘤药物是目前肿瘤治疗中迫切需要解决的问题。在我们的前期工作中，已发现了具有免疫调节活性的

9、板蓝根组酸（又名板蓝根高级不饱和脂肪酸） 2 ，且其具有较好的体内外抗肿瘤活性35 。为了研究板蓝根组酸的抗肿瘤定量构效关系，我们合成了一系列类似物并研究了其抗肿瘤活性69 。我们还发现芥酸等高级脂肪酸具有较好的载体作用。我们进而以芥酸和双(2-氯乙基)胺盐酸盐为原料，采用经典的酰化反应，选择微型有机合成技术首次合成了 N，N-二(2-氯乙基)芥酸酰胺。我们还合成了一系列的板蓝根组酸类似物，期望经过结构改造，能合成新的活性药物及改善药物的通透性。1 材料与仪器1.1 试剂与仪器芥酸（由四川天宇油脂化学有限公司提供） ，氯化亚砜（AR，汕头西陇化工） ，双(2-氯乙基)胺盐酸盐（AR，保定加合精

10、细化工有限公司） ，吡啶（AR，广东光华化学厂有限公司） ，四氢呋喃（AR，广东光华化学厂有限公司） ，二氯甲烷（AR，广东光华化学厂有限公司） ，醋酸乙酯（AR，广东汕头市西陇化工） ，石油醚（AR，广东光华化学厂有限公司） ，薄层层析用硅胶 H（CP，青岛海洋化工有限公司） ，RPMI-1640 培养基(HyClone 公司)，胎牛血清(HyClone 公司)，无水乙醇（AR，广东汕头市西陇化工） 。1.2 仪器 AE240 双量程分析天平(METTLER-TOLEDO)，瑞士布鲁克AVANCE AV 500MHZ 超导核磁共振谱仪，ML-902 定时、恒温磁力搅拌器（上海浦江分析仪器厂）

11、 ，MERCK 板，倒置显微镜(Leica,301-185.104-000)，Epics XL 流式细胞仪（美国 Coulter 公司） 。1.3 细胞株 Tca8113 细胞株（广西医科大学病理生理实验室提供），S180（购于中国科学院上海细胞库） 。1.4 实验动物 BALB/c 小鼠，1822 g，10 只；KM 小鼠，1822 g，雌雄各半，共 50 只。由广西医科大学实验动物中心提供。2 方法与结果2.1 N，N-二(2-氯乙基)芥酸酰胺的合成在 20ml 微型二口烧瓶中加入芥酸 11.8 mmol（4.0 g） ，加入氯化亚砜 41.4 mmol（3.0 ml） ，吡啶两滴。磁力搅

12、拌 70C 反应 4 h。抽干氯化亚砜，加入四氢呋喃 6ml 和双(2-氯乙基)胺盐酸盐 16.8 mmol（3.0 g） ，室温反应 12 h，至薄谱层析显示原料几乎完全转化时停止10 。反应停止后，反应混合液加入 pH 34 的盐酸水溶液 30 ml，振荡 30 min，然后加入 20 ml 二氯甲烷，待混合物分成两相，弃上层；下层用 pH 34 的盐酸水溶液 10 ml，洗涤两次，弃上层水洗液，干燥。反应方程式如下：CH3(CH2)7CH=CH(CH2)11COOH+SOCl2Pyridine70，4hCH3(CH2)7CH=CH(CH2)11COCl(ClCH2CH2)2NHHClTH

13、F，r.t.，12hCH3(CH2)7CH=CH(CH2)11CONCH2CH2ClCH2CH2Cl2.2 分离纯化取粗产物 2.0 g，酸性氧化铝 70 g，常压硅胶柱层析法，用石油醚醋酸乙酯（991）进行淋洗。分段收集，TLC 法检测，合并相同流分，回收溶剂。分离得无色化合物 0.50 g。产物以 1H-NMR 和 13C-NMR 进行结构鉴定。2.3 结构鉴定产物以 1H-NMR 和 13C-NMR 进行结构鉴定。1H-NMR（500MHz，CDCl3）ppm：5.36（2H，m，-CH=CH-） ，4.12（4H，s，-N-CH2-） ，3.58（4H，s，-N-C-CH2-） ，2.

14、31（2H，t，-CH2-CON-） ，2.03（4H，m，-CH2-C=C-CH2-） ，1.62（2H，m，-CH2-C-CON-） ，1.3024，m，-（CH2）n- ，0.88（3H，t，CH3-C-） 。13C-NMR（500MHz，CDCl3）ppm：173.767，130.327，129.869，63.306，44.376， ，34.308，31.900，29.769，29.655，29.593，29.536，29.515，29.456，29.308，29.251，29.196，29.158，27.206，26.129，24.979，22.664，22.7。根据反应物结构，综合

15、以上光谱数据，鉴定该化合物为目标产物N，N-二(2-氯乙基) 芥酸酰胺。2.4 体外抗肿瘤作用的研究将对数生长期的 Tca8113 细胞以 0.25%的胰蛋白酶消化，调整细胞浓度为 1105 个/ml，置于 12 孔培养板， 1 ml/well，于 37、5%CO2 培养箱中培养 24 h。将不同浓度的样品加入不同的孔，配好的样品微乳液的浓度依次为500，300，200，100，50，10，5，1.5，0.5，0.15 g/ml，阳性对照加入阿霉素，空白对照加等体积的 10%胎牛血清的 RPMI1640 培养基，阴性对照加入与配药所用相同比例的溶剂和培养基，每个浓度做两个复孔。混匀，37、5%

16、CO2 培养箱中培养 24 h，于倒置显微镜下观察细胞形态，收集所有细胞（包含上清液中漂浮的细胞） ，加入 PI 染液，室温、避光孵育 30 min，流式细胞仪检测 PI 自发荧光强度以判断细胞死亡率。N，N-二(2-氯乙基)芥酸酰胺作用于 Tca8113 细胞，在 0.1510.0 g/ml 的浓度范围有较强的杀伤效应，镜下观察细胞变圆，贴壁性能减弱，细胞上浮明显，细胞克隆生长状态受抑制，而且细胞收缩，折光度变差，未能保持上皮样生长方式，如图 12 所示。经流式细胞仪检测结果显示与上述一样，其在 0.1510.0 g/ml 的浓度范围有较强的杀伤效应，杀伤率均超过 30%，但与浓度递增无明显

17、的正相关，在 100.0 g/ml 以上的浓度反而杀伤效果不佳。结果见表 1。表 1 化合物N，N二(2-氯乙基)芥酸酰胺体外对 TCA8113 细胞杀伤效应(略)2.5 体内抗肿瘤作用的研究 S180 经细胞培养体外扩增，在BALB/c 小鼠腹腔内传代，取第 4 代的腹水细胞，用 0.9%氯化钠洗涤两次，将细胞浓度调整至 1108ml-1，接种于 KM 鼠腹腔，0.2 ml/只。接种24 h 后腹腔注射给药，N，N-二(2-氯乙基)芥酸酰胺分高、中、低 3 个剂量（7.5，5，2.5 mg/kg） ，1 次/d，连续给药，直到死亡。计算体重增加率、平均存活时间和生命延长率。实验中设阳性对照组

18、（环磷酰胺 10 mg/kg）及阴性对照组。实验结果表明，N，N-二(2-氯乙基)芥酸酰胺对小鼠 S180 腹水瘤生长有一定的抑制作用，结果见表 2。中剂量 5 mg/kg 时，其存活时间与阴性对照组和阳性对照组相比均有差异，且差异有统计学意义，P 值分别为0.001 和 0.008；生命延长率为 38.20，与阳性对照组相比差异有统计学意义(P=0.008)；受试组体质量增加率也明显降低，中剂量组体质量平均增长速率为 2.45%。表 2 N，N-二(2-氯乙基)芥酸酰胺对 KM 小鼠 S180腹水瘤的抑制作用(略)3 讨论经核磁共振谱证实终化合物为目标产物，并且是一种新的化合物。在体外的抗肿

19、瘤实验中，我们将 N，N-二(2-氯乙基)芥酸酰胺作用于Tca8113 细胞，并进行了定性及定量观察。首先对癌细胞生长状态，包括细胞形态、生长方式的影响进行观察，然后经流式细胞仪作定量检测。结果表明，N，N-二(2-氯乙基)芥酸酰胺对 Tca8113 细胞在较低浓度范围有明显的杀伤作用，在 100.0 g/ml 以上的浓度反而杀伤效果不佳。在体内实验中，N，N-二(2-氯乙基)芥酸酰胺 5.0 mg/kg 对 S180 腹水瘤有明显的抑制作用，能很大程度上延长小鼠的存活时间。体内外实验结果一致，此结果表明药物浓度递增与杀伤作用无明显的正相关。脂肪酸由于具有脂溶性大，能透过组织进入肿瘤细胞内和靶

20、器官；其分子量较大，化学性质活泼，所以不仅能直接作为抑制肿瘤的药物，也能作为一种载体，携带药物进入到靶器官；也能经过结构改造，合成新的活性更强的药物。有研究报告11,12 ，由磷脂、胆固醇和油酸所组成的油酸多相脂质体（PL139）是与生物膜类似超微粒球状体，作为载体能携带药物进入细胞内，能提高巨噬细胞的吞噬功能。脂质过氧化产生的活性氧能提高肿瘤细胞对药物的敏感性13 ，产生的自由基和脂质过氧化物则可抑制肿瘤细胞的表达，缩短染色体的端粒，促进肿瘤细胞的凋亡14 。氮芥类化合物能与 DNA 碱基共价结合而产生 DNA 的交叉联结,而主要与 DNA 分子大沟中(DNA major groove)的鸟

21、嘌呤的 N 反应，使DNA 分子因发生交叉联结而断裂，从而干扰 DNA 的复制或转录15, 16 。N，N-二(2-氯乙基)芥酸酰胺是一种脂肪酸，其杀伤肿瘤细胞的机理可能是以一种载体进入细胞内，使 DNA 结构和功能发生改变，阻止 DNA 复制，造成细胞 DNA 损伤，杀伤肿瘤细胞。综上所述，N，N-(2-氯乙基)芥酸酰胺在体内外都具有很明显的抗肿瘤作用，不具有浓度依赖性，是肿瘤化疗极具潜力的药物，其抗肿瘤机制有待进一步深入研究，具有一定的实际应用意义。致谢：本研究受到广西大型仪器协作共用网资助。【参考文献】1Baraldi PG，Berial，Cozzi P，et al.Cinnamoyl

22、nitrogen mustard derivatives of Pyrazole analogues of tallimustine modified at theamidino moiety:design，synthesis，molecular modeling and antitumor activity studies.BioorgJ.Med.Chem，2004，12(14):3911.2秦 箐，贺海平，Soren Brogger Christensen, 等.中药板蓝根中高级不饱和脂肪酸的分离鉴定及免疫活性成分的研究J.中国现代医学杂志，2001，11(1)：15.3侯华新，黎丹戎，韦

23、长元，等.板蓝根高级不饱和脂肪酸对耐药肝癌细胞株 BEL-7404/ADM 逆转作用实验J 中国现代应用药学杂志，2002，19（5）：351.4侯华新，秦 箐，黎丹戎，等.板蓝根高级不饱和脂肪阻致的体外抗人肝癌 BEL-T402 细胞活性J.中国临床药学杂志，2001，11（1）：16.5侯华新，黎丹戎，秦 箐，等.板蓝根高级不饱和脂肪组酸体内抗肿瘤实验研究J.中药新药与临床药理，2002，13（3）：156.6秦 箐，林 华，刘雪梅，等.芥酸乙酯的微型有机合成J.广西科学院学报，2006，22（S1）：399.7林 华，秦 箐，刘雪梅，等.芥酸苯甲酯的微型有机合成J.广西科学院学报，200

24、6，22（S1）：401.8李海冬，林 华，秦 箐，等.芥酸异丙酯的微型有机合成J.广西科学院学报，2006，22（S1）：397.9莫德欢， 林 华，邝晓聪，等.芥酸环己酯的微型有机合成及抗肿瘤活性研究J.广东化工，36（2）：20.10秦 箐.Soren Brogger Christensen，Hasse Bonde Rasmussen，et al3,5-二甲基苯甲酸 2-乙酮基苯酚酯的微型有机合成和结构测定J.内蒙古民族大学学报（自然科学版） ，2003，198（1）：23.11郭诗玖，董成代，刘邦玲，等.油酸多相脂质体（PL139）对恶性肿瘤疗效观察J.肿瘤，1989，9（1）：35.12孙润广，张 静，王永昌.脂肪酸多相脂质体与癌细胞膜相互