p38 MAPK在高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化中的作用.doc

1、p38 MAPK 在高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化中的作用作者：吕智美 邓华聪 诸葛福媛 刘金波 冯正平 陈丹燕 南静 【摘要】 目的: 探讨 p38 MAPK 在高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化中的作用. 方法: 将体外培养的人肾小管上皮细胞（HK2）分为正常对照组（NG）, 高糖组（HG）, 无关 siRNA 转染组（RG） 、转染 p38 MAPK siRNA 24 h 组(24hG) 、转染 p38 MAPK siRNA 48 h 组(48hG). 免疫细胞化学法检测 平滑肌肌动蛋白(SMA) 和细胞角蛋白(CK)的表达，RTPCR法检测 CK mRNA 的表达，Western Blot

2、 检测 p38 MAPK 的活化及 SMA的表达. 结果 : p38 MAPK siRNA 能显著抑制高糖诱导的 p38 MAPK 过度活化；高糖刺激后肾小管上皮细胞 SMA 蛋白表达明显高于正常组（P0.05） ，而 p38 MAPK siRNA 转染组其水平显著低于高糖组（P0.05） ；高糖诱导 HK2 细胞 CKmRNA 和蛋白水平明显降低（P0.05） ，而 p38 MAPK siRNA 转染后其水平显著高于高糖组（P0.05） ；结论: 高糖可导致肾小管上皮细胞 p38 MAPK 通路的激活而下调 CK，同时导致 SMA 蛋白的表达，诱导其表型转化. 【关键词】 p38 丝裂原活化

3、蛋白激酶类；肾小管；上皮细胞；上皮间质转分化 0 引言 糖尿病肾病(DN)是糖尿病的主要微血管并发症，而肾脏纤维化是糖尿病肾病进展为慢性肾功能衰竭的病理基础. 研究发现，肾小管上皮细胞转分化为间充质细胞(epithelialmesenchymaltransition, EMT)是肾间质纤维化发生机制之一1. p38 丝裂素激活蛋白激酶(p38 MAPK) 是脊椎动物体内广泛存在的丝氨酸苏氨酸蛋白调节激酶，在糖尿病肾病的发生和发展中发挥重要作用2-3. 我们应用 RNA 干扰技术(siRNA) 抑制肾小管上皮细胞 p38 MAPK 基因的表达，观察其对高糖诱导的肾小管上皮细胞转分化的影响，以探讨

4、 DN 肾间质纤维化的机制，为糖尿病肾病的基因治疗提供实验依据. 1 材料和方法 1.1 材料人近端肾小管上皮细胞株2(HK2)( 美国 ATCC). 鼠抗人SMA( 美国 Santa Cruz 公司), 鼠抗人 CK 抗体(北京中杉公司), p38和磷酸化 p38(Pp38) 抗体(cell signaling 公司)，通用型 RTPCR 试剂盒(日本 TaKaRa 公司)， LipofectamineTM2000(美国 Invitrogen 公司).1.2 方法 1.2.1p38 MAPK siRNA 转染人 p38 特异性 siRNA 序列：Sense, 5GAAGCTCTCCAGACC

5、ATTT3; Antisense,5AAATGGTCTGGAGAGCTTCTT3. 用 Blast 搜寻 EST 基因库，对选中的 siRNA 序列同源性分析. 将适量 HK2 细胞接种于培养板，分别转染重组 PshRNAp38 MAPK 和无关对照质粒，依LipofectamineTM2000 转染试剂盒说明书进行操作. 1.2.2 细胞培养及分组 HK2 用含 100 mL/L FCS 的 DMEM 培养液传代培养. 分为 5 组：正常对照组(NG): 培养液中含 D 葡萄糖(5.5 mmol/L);高糖组(HG):培养液中含 D 葡萄糖(30 mmol/L);无关 siRNA 转染组(R

6、G):无关 pshGSP 转染细胞 24 h 后, 再给予 D 葡萄糖(30 mmol/L);转染p38 MAPKsiRNA 24 h 组(24hG):pshRNAp38 MAPK 转染细胞 24 h 后，再给予 D 葡萄糖(30 mmol/L);转染 p38 MAPK siRNA 48 h 组(48hG):pshRNAp38 MAPK 转染细胞 48h 后，再给予 D 葡萄糖(30 mmol/L). 每组均加入等量脂质体，给予 D 葡萄糖作用 48 h 后收集细胞和培养液用于各项检测. 各组细胞分别用相差显微镜和透射电镜进行观察. 1.2.3 免疫细胞化学法检测 CK 和 SMA 表达 HK

7、2 细胞爬片，待细胞长至亚融合状态，以无血清培养基继续培养 24 h 使其同步化，分组如前述. 根据 SP 试剂盒所示方法检测 CK，SMA 的表达. 生物医学图像分析系统进行图像分析，用平均吸光度表示阳性物质的相对含量. 1.2.4RTPCR 实验各组按照 Trizol 说明书提取总 RNA，根据 260 nm吸光度值计算 RNA 浓度. 取总 RNA 1 g 作逆转录，步骤参照试剂盒说明. CK 引物正义链：5CCCAGAGCCTTGAGATAGAAC3 ，反义链:5CACGACCTTGCCATCCAC3. actin 引物正义链5CACCAACTGGGACGACAT3 ，反义链:3GCA

8、ACGATAGGTCCGACA5. 反应参数: 变性 94 2 min，变性94 30 s，退火 55 30 s，延伸 72 2 min，35 个循环. PCR 产物琼脂糖凝胶电泳，CK mRNA 表达以 actin 作为内参照物调整后进行半定量分析. 1.2.5Western Blot 检测收集细胞，提取蛋白，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度. SDS 聚丙烯酰胺凝胶上样，积层胶电压 50 V 电泳，分离胶6065 V 电压电泳， 50 V 转膜 2 h， BSA 封闭 l h，一抗p38，Pp38(11000) 或 SMA(1200) ，actin(12000) 孵育过夜，洗涤后加二抗(12500

9、) 室温反应 1 h，曝光、显影. 凝胶成像和化学发光分析系统进行灰度分析. 统计学处理：数据用 xs 表示，采用统计学软件 SPSS11.0 进行统计学处理，多组计量资料经检验方差齐同，采用单因素方差分析，组间多重比较采用 LSDt 检验，P0.05 为差异有统计学意义. 2 结果 2.1 细胞形态学改变倒置显微镜下，正常 HK2 细胞为椭圆形贴壁生长. 高糖刺激后，细胞间隙增大，呈梭形，失去鹅卵石样形态. 转染 p38 MAPKsiRNA 后，部分细胞为椭圆形，部分转变为梭形. 透射电镜下，正常对照组细胞表面微绒毛积聚，细胞内线粒体丰富，粗面内质网少. 高糖组和无关转染组与正常对照组相比，

10、细胞表面微绒毛明显减少，胞质内粗面内质网丰富，线粒体极少. 而转染 p38 MAPKsiRNA 组与高糖组和无关转染组相比，细胞表面微绒毛增多，细胞内粗面内质网减少，线粒体增多(图 1). A:正常对照组; B:高糖组; C:无关 siRNA 转染组; D:转染 p38 MAPKsiRNA 24 h 组; E:转染 p38 MAPKsiRNA 48 h 组. 图 1 各组 HK2 细胞超微结构改变 2.2p38 MAPKsiRNA 对肾小管上皮细胞 p38 MAPK 表达的影响Western Blot 检测显示，高糖组和无关转染组 p38 MAPK 被磷酸化激活，与正常对照组相比差异有统计学意

11、义（P0.05） ；在 p38 MAPKsiRNA转染组，p38 MAPK 的磷酸化水平较高糖组和无关转染组明显下调（P0.05, 图 2）. 1:正常对照组; 2:高糖组; 3:无关 siRNA 转染组; 4:转染 p38 MAPKsiRNA 24 h 组; 5:转染 p38 MAPKsiRNA 48 h 组. 图 2 各组 HK2 细胞 p38 MAPK 的表达 2.3p38 MAPKsiRNA 对肾小管上皮细胞 CK 和 SMA 表达的影响免疫细胞化学结果显示，与正常对照组相比，高糖组和无关转染组 CK 表达显著降低，差异有统计学意义；p38 MAPKsiRNA 转染组，与高糖组和无关转

12、染组相比 CK 表达显著增加(P0.05,表 1). SMA 免疫细胞化学结果显示，与正常对照组相比，高糖组和无关转染组 SMA 表达水平显著增加；p38 MAPKsiRNA 转染组与高糖组和无关转染组相比SMA 表达水平显著降低，差异有统计学意义(P0.05,表 1).与正常对照组相比，高糖组和无关转染组 CK mRNA 扩明显降低，差异有统计学意义. p38 MAPKsiRNA 转染后，其水平较高糖组和无关转染组明显增高，差异有统计学意义（P0.05，图 3). 高糖组和无关转染组在43KD 可见 SMA 蛋白表达，正常对照组未见 SMA 表达，差异有统计学意义. 而 p38 MAPKsi

13、RNA 转染组 SMA 蛋白表达水平较高糖组和无关转染组明显降低（P0.05，图 4). 表 1 各组 HK2 细胞 CK 及SMA 蛋白表达的变化 3 讨论 肾脏纤维化是糖尿病肾病（DN）进展为慢性肾衰的病理基础，细胞外基质过度聚积是肾脏纤维化的主要原因. 研究证实，肾小管上皮细胞转分化是肾间质纤维化发生的重要机制之一4-5. 深入了解转分化的发生机制，对于早期防治糖尿病肾病具有十分重要的意义. M:marker;1:正常对照组; 2:高糖组; 3:无关 siRNA 转染组; 4:转染p38 MAPKsiRNA 24 h 组; 5:转染 p38 MAPKsiRNA 48 h 组. 图 3 各

14、组 HK2 细胞 CK mRNA 表达的水平 1：正常对照组; 2:高糖组; 3:无关 siRNA 转染组; 4:转染 p38 MAPKsiRNA 24 h 组; 5:转染 p38 MAPKsiRNA 48 h 组. 图 4 各组 HK2 细胞 SMA 蛋白表达的影响 SMA 是肌成纤维细胞的标志性蛋白，肌成纤维细胞是活化的成纤维细胞，具有很高的合成细胞外基质的作用，是引起肾间质纤维化的主要原因6. 正常情况下，肾小管上皮细胞表达其标志蛋白 CK，不表达SMA. 我们实验发现，高糖可以刺激 HK2 细胞发生形态学改变，细胞逐渐由卵圆形拉长成梭形，微绒毛明显减少，粗面内质网明显增多；这提示细胞失

15、去了上皮特性而表现为成纤维细胞特性. 同时，正常对照组几乎无 SMA 的表达，但高糖作用下 SMA 高表达，而 HK2 的标志蛋白 CK 的表达明显下调，表明高糖诱导肾小管上皮细胞表型转化，可能是糖尿病肾病肾间质纤维化的重要机制之一. p38 MAPK 为信号转导通路的交汇点，在糖尿病肾病的发生发展起到重要的作用7. 本实验成功构建 pshRNAp38 MAPK 表达载体，能有效抑制 p38 MAPK 的表达 . 转染 pshRNAp38 MAPK 后， p38 MAPK 的表达被抑制，HK2 细胞 SMA 的表达明显低于高糖组和无关转染组，而 HK2的标志蛋白 CK 的表达较高糖组和无关转染

16、组明显增加. 同时形态学检查显示，p38 MAPK siRNA 转染组细胞形态介于对照组与高糖组之间，部分细胞为椭圆形，部分转变为梭形，同时细胞表面微绒毛较高糖组明显增多，胞浆内粗面内质网较高糖组减少. 表明高糖可通过 p38 MAPK 活化诱导肾小管上皮细胞转分化，参与糖尿病肾病的纤维化进程. 本研究表明，高糖能够导致肾小管上皮细胞 p38 MAPK 通路的激活，下调 CK 表达，同时导致 SMA 等间充质细胞表型的表达，诱导其表型转化，而 p38 MAPKsiRNA 能有效抑制其发生，p38 MAPK 作为肾小管上皮细胞转分化中的重要因子，成为糖尿病肾病纤维化干预的中心环节，该研究为应用

17、RNAi 糖尿病肾病的基因治疗提供实验依据. 【参考文献】 1 Fan L, Sebe A, Peterfi Z, et a1. Cell contactdependent regulation of epithelialmyofibroblast transition via the rhorho kinasephosphomyosin pathway J. Mol Biol Cell, 2007, 18(3): 1083-1097. 2 Sakai N, Wada T, Furuichi K, et a1. Involvement of extracellular signalregula

18、ted kinase and p38 in human diabetic nephropathy J. Am J Kidney Dis, 2005, 45(1): 54-65. 3 Komers R, Lindsley JN, Oyama TT.Renal p38 MAP kinase activity in experimental diabetes J. Lab Invest, 2007, 87(6):548-558. 4 Neil GD, Orfhlaith ES, Declan AH, et al. TGF induced EMT can occur independently of

19、its proapoptotic effects and is aided by EGF receptor activation J. Am J Physiol Renal Physiol, 2006, 290(5): 1202-1212. 5 White LR, Blanchette JB, Ren L, et al. The characterization of alpha5integrin expression on tubular epithelium during renal injury J. Am J Physiol Renal Physiol, 2007, 292(2): 5

20、67-576. 6 Faulkner JL,Szcykalski LM,Springer F,et al. Origin of interstitial fibroblasts in an accelerated model of angiotensin IIinduced renal fibrosis J. Am J Pathol, 2005, 167(5): 1193-1205. 7 Chen Y, Blom IE, Sa S, et al. CTGF expression in mesangial cells: involvement of SMADs, MAP kinase, and PKCJKidney Int, 2002, 62(4): 1149-1159.