Urocortin 致大鼠心肌细胞肥大由PKA信号通路介导.doc

1、Urocortin 致大鼠心肌细胞肥大由 PKA 信号通路介导作者：梁春光，王洪新，刘春娜，刘杰,黄雷【摘要】 目的 通过观察 PKA 拮抗剂 H-89 和 CRF 受体拮抗剂Astressin 抑制 UCN 诱导乳大鼠心肌细胞肥厚的作用，研究 UCN 诱导的大鼠心肌细胞肥厚的信号转导机制。方法 以体外培养的乳大鼠心肌细胞为模型，应用 UCN 0.1 molL-1 诱导心肌肥大，观察 H-89 0.1 molL-1 和 Astressin 1 molL-1 的作用，探讨 UCN 0.1 molL-1 对心肌肥厚的作用机制。用消化分离法及计算机图像分析系统检测心肌细胞体积；3H亮氨酸掺入法测定心

2、肌细胞蛋白的合成；用 Western 蛋白印迹法测定 ANP 表达。结果 UCN 0.1 molL-1 使心肌细胞体积、蛋白合成和 ANP 表达明显增加，H-89 0.1 molL-1 和Astressin 1 molL-1 抑制 UCN 诱导的心肌肥大。结论 Urocortin 可能通过 CRF-R2 并通过 PKA 信号通路诱导乳大鼠心肌细胞肥大。 【关键词】 Urocortin 心肌肥大 PKA H-89Abstract: Objective To observe the inhibitive effects and signal transduction by H-89 and CRF

3、 receptor antagonist Astressin on hypertrophic myocardial cells induced by UCN in neonatal rats and study the signal transduction mechanism of hypertrophic myocardial rats induced by UCN. Methods Using the myocardial cells of neonatal rats cultured in vitro as models, and inducing myocardial hypertr

4、ophy by using UCN 0.1 molL-1 to observe the effect of H-89 0.1 molL-1 and Astressin 1 molL-1 and discuss the mechanism of effect of UCN 0.1 molL-1 on myocardial hypertrophy. The cardiomyocytes volumes were measured by computer photograph analysis system. The protein synthetic rate was obtained throu

5、gh measuring the incorporation of 3H-leucine into myocyte protein by liquid scintillation method. The expression of ANP was determined by western-blot. Results UCN enhanced the cardiomyocyte volume, the synthesis and the expression of ANP. H-89 0.1 molL-1 and Astressin 1 molL-1 can inhibit myocardia

6、l cells hypertrophy induced by UCN. Conclusions The hypertrophic effect of UCN in neonatal rats cardiomyocytes is mediated via CRF-R2 and activation of the PKA pathway.Key words：Urocortin; myocardial cells hypertrophy; PKA; H-89Urocortin(UCN)是在 1995 年新发现的一个神经肽，研究发现 UCN在心脏中1有表达，是一个很重要的心血管活性肽。UCN 可以使新

7、生大鼠心肌细胞 ANP 和 BNP 分泌显著增加2 ，而且 UCN mRNA 在肥大心肌上的表达数量明显比在正常心脏上的表达数量高3 ，均说明 UCN 参与心肌肥大作用。UCN 与 CRF-R2 具有很高亲和力4，5 ，实验表明 UCN 能够使心肌细胞内 cAMP 积聚增加2300。大量实验也表明 PKA 信号通路参与心肌肥厚作用。 为了进一步探讨 UCN 诱导心肌肥厚的作用机制，本研究在 UCN 体外诱导心肌肥大基础上，重点观察应用 PKA 抑制剂 H-89 和 CRF-R 拮抗剂Astressin 对心肌肥大的影响。1 材料与方法1.1 实验动物生后 23 d 的 SD 乳大鼠，雌雄不拘，

8、由辽宁医学院试验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（辽）2003-0007。 1.2 药品与试剂胰蛋白酶、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate,SDS） 、DMEM培养基、Urocortin、H-89(PKA 抑制剂)、Astressin（CRH 受体拮抗剂）均为美国 Sigma 公司；小牛血清为杭州四季青生物工程材料有限公司；3H亮氨酸为上海原子核研究所产品；ANP 一抗：Millipore 公司；其他试剂均为分析纯。1.3 体外乳大鼠心肌细胞培养在无菌条件下，取生后 23 d 的 SD 大鼠心脏，放入 Hanks 液冲洗 3 次后，剪成约 1 mm3 的小碎块，用

9、 0.8 gL-1 胰蛋白酶消化分离细胞，向分离的细胞中加人 15的小牛血清，84的 DMEM 培养基，1的双抗液(含 110 UL-1 青霉素,100 g 链霉素)的培养基，及 0.1 mmol/L 5-溴脱氧尿苷，吹打均匀后以 1109L-1 的密度接种于 24 孔培养板，送入通以 5%CO2 及 95%空气的二氧化碳孵箱中培养。1.4 分组及给药方法常规培养心肌细胞 2 d 后，换液，为了减少血清成分对实验结果的影响，换液时更换含 0.4小牛血清的培养基及各种浓度的试剂。设对照组，其他组分别加入 UCN(0.1 molL-1)；H-89（10 molL-1） ；H-89 + UCN ；

10、Ast（1 molL-1)；Ast+UCN 。给药 48 h 后进行各项指标的测定。1.5 培养心肌细胞体积测量 细胞体积是通过测量细胞直径获得的。用 D-Hanks 液快速冲洗长满细胞的培养孔 3 次，每孔加 0.3 mL 胰蛋白酶（1 gL-1） ，放入 37 恒温箱中 30 min 后，再加入 0.2 mL 含有体积分数为 0.1 血清的培养基终止消化，收集细胞注入一细胞室内（该细胞室底部是一经硅化的盖玻片，以防心肌细胞贴壁） ，在放大 400 倍的倒置显微镜下观察其细胞，几乎均呈球形。用计算机 CIAS 大恒细胞图象分析系统测量单个细胞的直径，进而计算出细胞的体积。每孔随机选择 4 个

11、视野，每个视野测 20 个细胞6 。1.6 培养心肌细胞蛋白质合成的测定培养 48 h 后更换含有 1 Ci3H-leucine 及各种浓度试剂的培养基，一起培养 72 h 后倒掉培养液，用冷 Hanks 液快速洗 3 遍，每孔加入 1 mL 10 gL-1SDS 溶解细胞，用 1 mL 50 gL-1 的trichloroacetic acid（TCA）沉淀蛋白，应用 GF/C 过滤，用 5 mL Hanks 液冲洗 3 遍，烘干滤膜，置于 4 mL 闪烁液(体积分数为 410-3PPO 的二甲苯溶液)的闪烁杯中。用液闪仪测量3Hleucine 的结合，进行蛋白合成的分析7 。1.7 WES

12、TERN BLOT 测 ANP 水平细胞加药作用 48 h 后，用细胞刮刀刮下细胞，用 PBS 冲洗下来，1 000 转/分，15 min，弃上清，把细胞沉淀置于-70 冰箱备用，测定指标时，取出样品放入 RIPA 缓冲液，并加入 10 mg/mL PMSF(Santa Cruz Biotechono1ogy，California，USA)，超声裂解后离心提取上清液。BCA法进行蛋白浓度测定(Pierce Biotechnology，Inc.IL，USA)分取 50 g加等体积的 2SDS 上样缓冲液并煮沸。然后各取 10 L 样品以及蛋白质标准物(Cell Signaling Tecnolo

13、gy，MA，USA)点样。Tris-SDS 聚丙烯酰胺凝胺垂直电泳 35 h，转膜 812 h；封闭，洗膜，然后以稀释后的兔抗大鼠 ANP(1200，Millipore Corporation)室温反应 2 h，再和二抗(11 500)各反应 l h， SupelSignal West Pico 试剂盒(Pierce Biotechnology，Inc，USA)中反应 5 min。显影条带经 1 200Pro 型图像扫描仪扫描，CAMIAS008 图像分析系统处理，根据积分吸光度值对比分析条带的强弱。1.8 统计学处理所有数据均以均数标准差(s) 表示，采用单因素方差分析及 LSD法进行统计学

14、处理。P0.05 认为有显著性差异，P0.01 认为有非常显著性差异。2 结果2.1 在 UCN 存在下，不同处理因素对心肌细胞体积的影响细胞体积是通过测量细胞直径获得的。表 1 结果显示，与对照组相比，UCN（0.1 M）组心肌细胞直径增加, H89（PKA 抑制剂，0.1 M）组和 Ast（CRH 受体拮抗剂，1 M）组细胞体积均未见明显改变，表明H-89 和 Ast 对正常心肌细胞无影响。而与 UCN 组相比，UCN+H-89 组、UCN+Ast 组心肌细胞体积均减小，表明 H-89 和 Ast 均能抑制 UCN 诱导的心肌细胞体积的增大。表 不同影响因素对大鼠心肌细胞体积的影响（略）*

15、P0.0l,与对照组相比较；#P0.01,与 UCN 组相比较2.2 在 UCN 存在下，不同处理因素对心肌细胞蛋白质合成的影响表 2 结果显示，与对照组相比，UCN（0.1 M）组心肌细胞蛋白合成增加,H89（PKA 抑制剂，10 M）组和 Ast（CRH 受体拮抗剂，0.1 M）组均未见明显改变，表明 H89 和 Ast 对正常心肌细胞蛋白合成无影响。而与 UCN 组相比，UCN+H-89 组、UCN+Ast 组心肌细胞蛋白合成均降低，表明 H-89 和 Ast 均能抑制 UCN 诱导的心肌细胞蛋白含量的增加。表 不同影响因素对大鼠心肌细胞3Hleucine 掺入量的影响（略）*P0.01

16、,与对照组相比较；#P0.01,与 UCN 组相比较2.3 不同处理因素对 UCN 作用的心肌细胞 ANP 表达含量的影响与对照组相比，UCN（0.1 M）组心肌细胞 ANP 表达明显增加；与对照组相比，H89 组和 Ast 组表达均未见改变，表明 H-89 和 Ast 并不影响正常心肌细胞 ANP 表达；与 UCN 组相比，UCN+H-89 组、UCN+Ast 组 ANP表达降低，表明 H-89 和 Ast 均能抑制 UCN 诱导的心肌细胞 ANP 表达含量的增加。图 3 不同影响因素对大鼠心肌细胞 ANP 表达含量的影响（略）*P0.01,与对照组相比较；#P0.01,与 UCN 组相比较

17、 3 讨论心肌肥厚作用是心脏的一种很重要的调整机制，是心脏负荷过重时一种代偿表现，是心肌细胞对高血压、瓣膜病、急性心肌梗塞等常见临床疾病的一种基本应答。疾病的初始阶段，心肌肥厚可以通过平衡应激的增加改善心脏的功能，然而，长时间应激所致的持续性心肌肥厚最终会因心脏功能失常导致心力衰竭，是心血管病患者死亡的重要原因之一。因此研究心肌肥厚的信号转导机制和确定此作用中的调节因子非常重要。许多研究已经表明，UCN 是一个很重要的心血管活性肽，其对心血管的生理作用可以通过 MAPK8 、PKC9 、PKA2302 等信号通路完成。有实验证明了 UCN 具有致心肌肥大作用，UCN 同源肽心肌肥厚作用由 Ak

18、t磷酸化介导10 。本实验研究发现，H-89 0.1 molL-1 能够抑制 UCN 诱导的心肌肥大，并发现特异性 CRF-R 拮抗剂也能够抑制 UCN 诱导的心肌肥大，且两者的作用相似，提示 PKA 及 CRF 受体参与了 UCN 诱导的心肌肥大过程。尽管 Keiichi Ikeda 等人2302 研究发现，用 UCN 处理的新生大鼠心肌细胞，心钠素(ANP)和脑钠素(BNP)的分泌显著增多，UCN (10-7M)增加ANP 和 BNP 分泌的作用可以被 H-89 阻断，而且 UCN 使心肌细胞内 cAMP 积聚。本实验用细胞肥大的指标测量 UCN 诱导的心肌肥大及其作用机制，将 UCN 特

19、异性受体拮抗剂引入实验。实验发现 Astressin 显著抑制 UCN诱导的心肌肥大，说明 UCN 诱导心肌肥大可能是通过与 CRF 受体相结合，进而进一步激活激活腺苷酸环化酶（AC） ，催化 ATP 转化成 cAMP，使细胞内 cAMP 浓度增高。cAMP 通过 cAMP 依赖性蛋白激酶（PKA）系统来实现细胞肥大作用。许多研究已经表明， Ca2+i 变化是心肌肥大的一个信号。大量实验表明， Ca2+i 的改变能通过多种钙调节酶来传导不同信号，其中Ca2+/CaMK 家族中钙调素依赖蛋白激酶发挥重要作用11-12 。UCN 诱导的心肌肥大是否有Ca2+i 变化，是否通过 Ca2+/CaMK

20、家族中钙调素依赖蛋白激酶发挥作用，本实验目前正在研究中。【参考文献】1 Yuichiro Kimura, Kazuhiro Takahashi, Kazuhito Totsune, et al. Expression of Urocortin and Corticotropin-Releasing Factor Receptor Subtypes in the Human Heart J . The Journal of Clinical Endocrinology Metabolism, 2002, 87: 1340-1346.2 Keiichi Ikeda, Katsuyoshi Tojo

21、, Shigeaki Sato, et al. Urocortin, a Newly Identified Corticotropin-Releasing Factor-Related Mammalian Peptide, Stimulates Atrial Natriuretic Peptide and Brain Natriuretic Peptide Secretions from Neonatal Rat Cardiomyocytes J. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1998,250（2）:298-304.

22、3 Toshio Nishikimi, Atsuro Miyata, Takeshi Horio, et al. Urocortin, a member of the corticotropin-releasing factor family, in normal and diseased heartJ. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2000,279: H3031-H3039.4 Toshihiro Suda, Kazunori Kageyama, Satoru Sakihara and Takeshi Nigawara. Physiological ro

23、les of urocortins, human homologues of fish urotensin I, and their receptorsJ.Peptides, 2004,25(10):1689-1701.5 Donaldson CJ,Sntton SW,Perrin MH,et al .Cloning and characterization of human urocortinJ.Enducrinology,1996,137(5):2167-2170.6 杨育红,王洪新.腺苷 A1 受体激动剂对异丙肾上腺素诱导心肌细胞肥大的抑制作用J. 高血压杂志,2003, 11(6):5

24、83-586.7 Weidong Zhu,Yunzeng Zou,Ichiro Shiojima,et a1. Ca2+/Calmodulin-dependent Kinase II and Calcineurin Play Critical Roles in Endothelin-1-induced Cardiomyocyte Hypertrophy J .Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science,2000,257:1523915245.8 Bhawanjit K Brar, Anna K Jonassen, Anastasis Step

25、hanou, et al. Urocortin Protects against Ischemic and Reperfusion Injury via a MAPK-dependent PathwayJ. J Biol Chem, 2000, 275(12): 8508-8514.9 Kevin M Lawrence,Alamgir MN Kabir, Mohamed Bellahcene, et al.Cardioprotection mediated by urocortin is dependent upon PKC activationJ. The FASEB Journal, 2005, 19(7):831-833.10 Chanalaris A, Lawrence KM, Townsend PA, et al. Hypertrophic effects of urocortin homologous peptides are