安喘颗粒提取工艺研究.doc

1、安喘颗粒提取工艺研究【摘要】 目的 优选安喘颗粒的提取工艺。方法 以盐酸麻黄碱为评价指标,选用正交表进行试验,考察麻黄等 6 味药的水提工艺中的用水量、提取时间及提取次数对盐酸麻黄碱含量的影响；以苦参碱、氧化苦参碱含量为评价指标,考察苦参等 2 味药的醇提工艺中的乙醇浓度、乙醇用量、提取时间及提取次数对苦参碱和氧化苦参碱含量的影响。结果 确定最佳方案为：麻黄等 6 味药材加水煎煮 2 次,每次 2 h,第 1 次加 854 mL,第 2次加 732 mL；苦参等 2 味药材加 80%乙醇回流提取 2 次,每次 2 h,第 1 次加 288 mL,第 2 次加 240 mL。结论 优选得到的提取

2、工艺合理、操作可行、质量可控。 【关键词】 安喘颗粒；正交试验；盐酸麻黄碱；苦参碱；氧化苦参碱；高效液相色谱法Key words：Anchuan Keli；orthogonal test；ephedrina hydrochloridum；matrine；ammothamnine；HPLC安喘颗粒原处方来源于江苏省中西医结合医院呼吸科朱启勇主任的临床验方,由麻黄、乌梅、甘草、苦参等 8 味药组成。安喘颗粒治疗支气管哮喘具有显著疗效。为克服原方汤剂用量较大且使用较为繁琐等不足,对本方进行开发。本研究采用正交试验法对提取工艺进行优选。l 仪器与材料AL204 万分之一电子天平(梅特勒公司产品)；Ag

3、ilent 1100 高效液相色谱仪(美国安捷伦公司产品),DAD 检测器,Agilent Chemstation 色谱数据工作站。盐酸麻黄碱(批号 171241-200303)对照品、苦参碱(批号0805-970)对照品、氧化苦参碱(批号 780-9001)对照品均购自中国药品生物制品检定所。乙腈、磷酸为色谱纯；甲醇为分析纯。麻黄 Ephedra sinica Stapf、苦参 Sophora flavescens Ait 等均购自南京市药材公司。2 方法与结果2.1 苦参等 2 味药材提取工艺2.1.1 正交试验设计 选择醇浓度、溶媒量、提取时间和提取次数,按 L9(34)正交试验。因素水

4、平见表 1。表 1 醇回流工艺因素水平表（略）2.1.2 苦参碱、氧化苦参碱含量测定 色谱条件：ZORBAX SB- C18(5 m,4.6 mm150 mm)色谱柱；流动相：乙腈-3%磷酸溶液(694)；检测波长：205 nm；流速：0.6 mL/min,柱温：室温。对照品溶液的制备：精密称取苦参碱、氧化苦参碱各适量,置于同一 10 mL 容量瓶中,用流动相稀释并定溶至刻度,摇匀；再从中精密吸取 1 mL,置于 5 mL 容量瓶中,加流动相稀释至刻度,摇匀,即得(1 mL 含苦参碱0.001 5 mg、氧化苦参碱 0.019 6 mg)。供试品溶液的制备：按照处方称取苦参等 2 味药各一定量

5、,按正交试验表(见表 2)各行所列条件制备样品。精密吸取上述样品溶液适量(约相当于苦参原药材 0.08 g),通过中性氧化铝柱(100200 目,5 g,内径 1 cm),依次用氯仿、氯仿-甲醇(73)各 20 mL 洗脱,合并洗脱液,回收溶剂至干,残留物用甲醇溶解并定容至 10 mL 容量瓶中,摇匀；从中精密吸取 1 mL 置 5 mL 容量瓶中,用乙腈-3%磷酸溶液(694)稀释并定容至刻度,摇匀,用微孔滤膜(0.45 m)滤过,即得。表 2 醇回流提取工艺正交试验结果（略）分别吸取对照品、样品溶液各 20 L,注入液相色谱仪,测定苦参碱、氧化苦参碱的含量。结果见表 2,方差分析见表 3表

6、 6。表 3 苦参碱含量方差分析（略）注：F0.01(2,2)=99.0,F0.05(2,2)=19.0 表 4 氧化苦参碱含量方差分析（略）注：F0.01(2,2)=99.0,F0.05(2,2)=19.0 表 5 综合评分方差分析（略）注：F0.01(2,2)=99.0,F0.05(2,2)=19.0直观分析结果表明,影响苦参碱的主要因素为 D,其次为 C,A 和 B 因素的影响最小,最佳水平组合为 A1B3C3D3；影响氧化苦参碱的主要因素为 D,其次为 B,A 和 C 因素的影响最小,最佳水平组合为 A3B3C3D3。因二者最佳组合不完全一致,且二者同等重要,因此,以各自最高数据计为

7、10 分,其余以此折算,并合计为综合评分(综合评分苦参碱含量/最高苦参碱含量1050%氧化苦参碱含量/最高氧化苦参碱含量1050%),结果表明(见表 6),影响的主要因素为 D,其次为 B 和 C,A 因素的影响最小,最佳水平组合为 A3B3C3D3。进一步以苦参碱为指标进行方差分析(见表 3),D 因素有显著性影响；综合考虑,A 因素影响均较小,所以 A 因素选择 A3；B 因素影响也较小,且B 因素的二、三水平差异较小,所以 B 因素选择 B3；C 因素的最佳水平均为 C3,因此 C 因素选择 C3。以苦参碱为指标,D 因素具有显著性,进一步对D 因素进行水平间多重比较(见表 6),结果表

8、明 D3 和 D1 之间有显著性差异,而 D3 与 D2、D2 和 D1 之间均无显著性差异。虽然最佳为 D3,结合生产实际和节省能源,拟选择 D2。因此,安排验证试验 A3B3C3D3 和A3B3C3D2。表 6 苦参碱含量 D 因素多重比较（略）2.1.3 验证试验 分别采用理论最佳工艺 A2B3C3D3 和拟采用的工艺 A3B3C3D2 制备样品。苦参碱、氧化苦参碱含量测定同“2.1.2”项下方法操作。结果理论最佳工艺的苦参碱含量为 0.661 8 mg/g 苦参原药材,氧化苦参碱含量为 21.039 4 mg/g 苦参原药材；拟采用工艺的苦参碱含量为 0.521 1 mg/g 苦参原药

9、材,氧化苦参碱含量为 20.020 7 mg/g 苦参原药材。试验结果表明,提取 3 次与提取 2 次相比,多提取一次苦参生物碱总含量仅增加了 5.34%,但是乙醇和能耗增加较大,因此,确定提取次数为 2 次。2.1.4 结论 根据正交试验和验证试验结果,确定苦参等 2 味药的提取工艺为药材加 80%乙醇回流提取 2 次,每次 2 h,第 1 次加 288 mL(考虑到干药材会吸约 2 倍量的水,根据实际第 1 次多加),第 2 次加 240 mL。2.2 麻黄等 6 味药材提取工艺预试验比较了麻黄单独水提取、70%乙醇提取,麻黄、乌梅、甘草等合并水提取,麻黄、乌梅、甘草等合并 70%乙醇提取

10、。结果表明,麻黄与乌梅、甘草等合并水提取和醇提取盐酸麻黄碱含量都分别略高于麻黄单独水提取和醇提取,因此,可以推测合煎时有机酸的存在更有利于盐酸麻黄碱的溶出,但合并醇提取盐酸麻黄碱含量比合并水煎煮仅提高 7.45%,综合考虑采用麻黄、乌梅、甘草等合并水提取。2.2.1 正交试验设计 选择加溶媒量、提取时间和提取次数,按 L9(34)进行正交试验。因素水平见表 7。表 7 水提取工艺因素水平表（略）2.2.2 盐酸麻黄碱含量的测定色谱条件：ZORBAX SB-C18 (5 m,4.6 mm150 mm)色谱柱；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液(1090)；检测波长：207 nm；流速：0.6 mL/

11、min,柱温：室温。对照品溶液的制备：精密称取盐酸麻黄碱 1.68 mg,置于 10 mL 容量瓶中,用流动相溶解至刻度,摇匀；从中精密吸取 1 mL,置于 10 mL 容量瓶中,用流动相稀释至刻度,摇匀,即得(1 mL 含盐酸麻黄碱 0.016 8 mg)。供试品溶液的制备：按照处方称取麻黄、乌梅、甘草等药材各一定量,按正交试验表(见表 8)各行所列条件制备样品溶液。精密吸取上述样品溶液适量(约相当于麻黄生药量 0.008 g),置中性氧化铝柱(100200目,1.5 g,内径 1 cm)上,用 50%甲醇溶液洗脱至 10 mL 量瓶中约至 9 mL,加 1 滴磷酸,用 50%的甲醇定容至刻

12、度,摇匀,用微孔滤膜(0.45 m)滤过,即得供试品溶液。分别吸取对照品、样品溶液各 20 L,注入高效液相色谱仪,测定盐酸麻黄碱的含量。结果见表 8。方差分析见表 9。 表 8 水提取工艺正交试验结果（略）表 9 盐酸麻黄碱含量方差分析（略）注：F0.01(2,2)=99.0,F0.05(2,2)=19.0直观分析结果表明,影响盐酸麻黄碱的主要因素为 C,其次为 A 因素,B因素的影响最小,最佳水平组合为 A3B3C3。进一步以盐酸麻黄碱进行方差分析,因素 A、B、C 均有极显著性影响。因此,A 因素拟选择 A3；同样,B因素拟选择 B3；虽然最佳为 C3,但从生产实际和节省能源角度考虑,可

13、以选择 C2。因此,安排验证试验 A3B3C3 和 A3B3C2。2.2.3 验证试验 分别采用理论最佳工艺 A3B3C3 和拟采用的工艺 A3B3C2 制备样品。盐酸麻黄碱含量的测定采用“2.2.2”项下方法操作。结果理论最佳工艺的盐酸麻黄碱含量为 25.13 mg/g 麻黄药材；拟采用工艺的盐酸麻黄碱含量为 24.75 mg/g 麻黄药材。试验结果表明,提取 3 次与提取 2 次相比,多提取一次盐酸麻黄碱含量仅增加了 1.54%,但能源消耗大大增加,因此,从生产实际出发确定提取次数为 2 次。2.2.4 结论 根据预试验、正交试验和验证试验结果,确定麻黄等 6 味药材的提取工艺为药材加水煎

14、煮 2 次,每次 2 h,第 1 次加 854 mL(考虑到干药材会吸约 2 倍量的水,根据实际第 1 次多加),第 2 次加 732 mL。3 讨论盐酸麻黄碱、苦参碱、氧化苦参碱的药理作用在很大程度上与该复方的传统功能主治及临床应用具有一致性。因此,选择盐酸麻黄碱、苦参碱、氧化苦参碱以及总提取物含量作为提取方法的考察指标较为合理。对苦参等 2 味药的醇提液进行苦参碱、氧化苦参碱含量测定时,按药典方法2测定,空白液有干扰。对药典的色谱条件进行改进,采用ZORBAX SB-C18(5 m,4.6 mm150 mm)色谱柱,流动相为乙腈-3%磷酸溶液(694),检测波长为 205 nm,可消除干扰。【参考文献】1 赵陆华.高效液相色谱法分析中药成分手册M.北京：中国医药科技出版社,1994.398.2 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)S.北京：化学工业出版社,2005.141.