斑点杂交法检测SEN病毒感染.doc

1、斑点杂交法检测 SEN 病毒感染作者：杨群，田德英，许东，葛娅，任星峰，宋佩辉 【关键词】 聚合酶链反应 【Abstract】 AIM: To explore the availability of dotblot assay in the detection of SEN virus infection. METHODS: Nuclear acid was extracted from serum specimens, and dotblot analysis and polymerase chain reaction(PCR) were carried out respectively t

2、o detect SENV DNA. RESULTS: Among 191 samples, 6 were found positive by dotblot, and 11 were found positive by PCR. CONCLUSION: The probe prepared by us is SENVspecific. Dotblot hybridization with DIGlabeled SENV DNA probe can be used to detect SENV DNA in sera samples. 【Keywords】 SEN virus; dotblot

3、; polymerase chain reaction 【摘要】 目的： 探讨斑点杂交法检测 SEN 病毒（SENV）感染的应用价值. 方法： 应用地高辛标记、制备 SENV 部分基因探针并用斑点杂交技术检测 SENV DNA，与聚合酶链反应 (PCR)检测结果相比较. 结果： 在 191 份血清中，采用斑点杂交法检出 6 份阳性，检出率为 3.1%. PCR方法检测出 11 份阳性，阳性率 5.8%. 结论： 制备的地高辛探针具有SENV 特异性，以地高辛标记的 SENV 探针可用于检测 SENV 感染. 【关键词】 SEN 病毒；斑点杂交；聚合酶链反应 0 引言 目前，国外对 SENV 基

4、因组研究表明，SENV 可分为 SENVA 至 SENVH 8个亚型，各亚型间基因序列差异在 15%50%之间，各亚型与 TTV 原型株间基因序列差异为 40%60%1. 尽管国内外学者对 SENV 感染进行了不少报道，但是仍然没有给出 SENV 的感染复制场所的直接证据2，3. 我们进行了地高辛标记 SENV 探针的研究并评价其对 SENV DNA 直接检测的应用价值. 1 材料和方法 1.1 材料系 1997/1998 收集的 191 例不同人群血清标本，包括慢性乙型肝炎患者、重症肝炎患者、非甲非戊肝炎患者、血浆置换患者、静脉吸毒者和正常人群. 所有血清样本采集后于-70冰箱保存. 1.2

5、 方法 1.2.1SEN 病毒核酸探针的制备选择 SENV 开放阅读框 2(ORF2)4 区域设计、由上海博亚生物技术服务有限公司合成引物. 外引物为: Sense primer: 5GAGTTTACACACCGCAG3 Antisense primer: 5 GTCTTATGTACCGTCTCC3；内引物为： Sense primer: 5GGTGGCACGGGATCCAAAAATGCACTTTTC3 Antisense primer: 5GGTGGCACG GATCCTAAAAATGCACTTTTC3. 通过套式 PCR 反应从患者血清中扩增得到长 511 bp 片段，连接 pRSETB

6、载体，转化大肠杆菌. 在挑取阳性克隆提取重组质粒进行测序鉴定后扩增重组质粒，以 BamH单酶切，琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，取 1 g 以博士德公司地高辛 DNA标记和检测试剂盒进行标记，操作按试剂盒说明书进行. 1.2.2 血清样品 DNA 的提取病毒核酸抽提试剂为美国 Biotronics 公司 Acupure DNA/RNA 提取试剂盒,取 50 L 血清加 100 L 裂解液充分混匀，80温浴 10 min,取出室温平衡 5 min，加 150 L 异丙醇混匀，经 15 000 g 10 min 离心沉淀，去除上清液，加 50 L 700 mL/L 乙醇试剂洗涤沉淀,再离心去除上清液，

7、室温风干，加 50 L 样品稀释液重悬样品，80温浴 5 min,离心后将上清液备用. 1.2.3PCR 检测取各份提取核酸 5 L 作为模板加入第 1 次 PCR 反应体系. 50 L 反应体系中镁离子终浓度为 15 mmol/L, dNTP 终浓度各为200 mol/L, Taq P 为 2 u，外引物各为 50 pmol，以 94变性 3 min，55退火 1 min，72延伸 3 min，30 个循环；取第 1 次 PCR 产物2 L 加入第 2 次 PCR 反应体系，50 L 反应体系中内引物各为 50 pmol，余同第 1 次 PCR,循环参数同第 1 次 PCR，共进行 30 个

8、循环. PCR结束后收产物加于 80 g/L 聚丙烯酰胺凝胶电泳，预期 PCR 产物应为 511 bp. 1.2.4 斑点杂交取各份提取核酸 20 L 及定量系列稀释重组质粒，煮沸 10 min 后立即置于冰浴，加入等体积 20SSC，点样于硝酸纤维素膜上，以真空泵抽吸，80烤膜 2 h，参照试剂说明书进行杂交及链酶亲合素生物素过氧化物酶复合物(SABCPOD),显色. 探针浓度为 25 g/L. 2 结果 2.1 斑点杂交检测结果检测标本共 191 份，其中 6 份为阳性，阳性率为 3.1%. 在同一张硝酸纤维素膜上，同时点上定量倍比稀释的 SENV 重组质粒（分别为 625.0, 125.

9、0, 25.0, 5.0, 1.0,0.2 和 0.04 pg） ，在质粒1.0 pg（换算成 SENV DNA 拷贝数相当于 2.7105）时可看到较明显的阳性斑点(Fig 1). 2.2PCR 检测结果 PCR 方法检测血清标本共 191 份，其中扩增出 11份阳性，阳性率 5.8%（Fig 2）. 2.3 斑点杂交与 PCR 结果比较在 191 份血清中，采用斑点杂交法检出6 份阳性血清， PCR 方法检测出 11 份阳性. 11 份 PCR 阳性者中 5 份斑点杂交阳性；另外 6 份 PCR 阳性者，斑点杂交为阴性. 1 份 PCR 为非特异性扩增产物者，斑点杂交为阳性，后经 TTVD

10、NA PCR 检测为阳性. 3 讨论 SENV 是一组无包膜、单链、环状的小 DNA 病毒，其基因组长度约为3900 个核苷酸. 从生物物理特征、基因组序列及其编码蛋白分析结果来看，SENV 和 TTV（输血传播病毒）原型株的序列同源性为 50%，氨基酸同源性仅为 3%，提示 SENV 不是 TTV 的变异株，而是从同一共同的祖先进化而来的、不完全相同的病毒组群，属于 TTV 超家族1. 和 TTV 相似，SENV 主要经输血或静脉注射毒品传播. 在美国志愿献血者 SENVD 和 SENH的感染率为 1.8%，住院患者感染率为 2.8%，提示人群感染率为2%3%2. 国内最近报道，我国北方人群

11、 SENV 感染率较国外要高的多（正常人群感染率为 62.5%） 4，5. 其原因除了有 SENV 感染的地区人群差异外，还可能与所用的 PCR 检测条件的差异有关. 因此建立特异性、直接检测 SENV DNA 的杂交方法十分必要. 我们采用地高辛标记 SENV 部分基因制备成双链 DNA 探针，在探针浓度为 25 g/L 时，在同一张硝酸纤维素膜上，同时点上定量倍比稀释的SENV 重组质粒，检测灵敏度可达 1.0 pg，换算成 SENV DNA 拷贝数相当于 2.7105. 对 191 份血清采用斑点杂交法检出 6 份阳性血清，检出率为 3.1%；PCR 方法检测出 11 份阳性. 11 份

12、 PCR 阳性者中 5 份斑点杂交阳性；另外 6 份 PCR 阳性者，斑点杂交为阴性. 1 份 PCR 为非特异性扩增产物者，斑点杂交为阳性，后经 TTVDNA PCR 检测为阳性. 斑点杂交和 PCR相比较，灵敏度要低于后者，但是对于 PCR 扩增出非特异性扩增产物不易确定阳性和阴性时，采用斑点杂交有助于特异性的鉴别，而且斑点杂交也可作为一种半定量的核酸检测技术，在病毒感染与临床表现相互关系的研究中有独特的优势. 我们制备了地高辛标记的 SENV 特异性探针，建立了 SENV 感染的斑点杂交检测法，为下一步 SENV 感染部位、复制场所及其致病性的研究奠定了基础. 【参考文献】 1 Tana

13、ka Y, Primi D, Wang RH, et al. Genomic and molecular evolutionary analysis of a newly identified infectious agent (SEN virus) and its relationship to the TT virus family J. J Infect Dis, 2001;183:359-367. 2 Umemura T, Anthony EY, Alessandra Sottini, et al. SEN virus infection and its relationship to

14、 transfusionassociated hepatitis J. Hepatology, 2001;33:1303-1311. 3 高志良，彭晓谋，姚春斓. 广州地区肝病患者肝组织中 SENV的发现J. 中华传染病杂志，2002；20（1）：30-32. Gao ZL, Peng XM, Yao CL. SENV DNA found in liver tissue from patients with non A to E hepatitis in Guangzhou area J. Chin J Infect Dis, 2002;20(1):30-32. 4 闫杰，何忠平，庄辉，等.

15、中国北方 5 城市慢性乙型肝炎患者中 SEN 病毒检测J. 中华流行病学杂志，2003；24（1）：33-35. Yan J, He ZP, Zhuang H, et al. Detection of SEN virus in sera of patients with chronic hepatitis B and general population in 5 cities of China J. Chin J Epidemiol, 2003;24(1):33-35. 5 Kao JH, Chen W, Chen PJ, et al. Prevalence and implication of a newly identified infectious agent(SEN Virus) in Taiwan J. Infect Dis, 2002;185:389-392.