补骨脂对A375人黑素瘤细胞增殖及黑素合成的影响.doc

1、补骨脂对 A375 人黑素瘤细胞增殖及黑素合成的影响作者：唐晓琴,闫明,高莉,彭晓明,胡佳惠【摘要】 目的 探讨含补骨脂大鼠血清对 A375 细胞增殖及合成黑素功能的影响。方法 体外培养 A375 人黑素瘤细胞,于对数生长期添加不同浓度含补骨脂大鼠血清,分别采用 MTT 法和 NaOH 法检测细胞增殖及合成黑素的情况。 结果 补骨脂高、中、低剂量含药血清组较空白血清组有明显促增殖作用,在 20%的添加浓度时,高、中、低 3 个剂量含药血清组随着剂量的增加,黑素含量也明显升高(P0.01)。结论 补骨脂含药血清有促进 A375 黑素瘤细胞增殖作用,并使 A375 人黑素瘤细胞合成黑素增加。 【关

2、键词】 补骨脂；含药血清；黑素合成；细胞增殖Abstract：Objective To study the effects of serum containing Psoralea on proliferation and melanogenesis in A375 human melanoma cells by serum pharmacological method. Method A375 human melanoma cells were cultured in vitro. Different concentrations of drug-contained serum were a

3、dded to the culture medium during logarithmic growth phase. Melanocyte culture was determined by MTT and NaOH method. Results There was a significant difference between the control and the drug-contained serum test group on proliferation, and there was significant increase in 20% serum drug-containe

4、d serum on melanogenesis (P0.01). Conclusion Serum containing Psoralea has strong effect of promoting A375 human melanoma cells proliferation and melanogenesis in vitro. Key words：Psoralea；drug contained serum；melanogenesis；cell proliferation补骨脂为豆科植物补骨脂 Psoralea corylifolia L.的果实,性味辛、苦、温,归肾、脾经1,具有温肾

5、助阳、纳气、止泻功效。历代中医常用于治疗肾虚、遗尿、泄泻、白癜风、秃发。研究发现,补骨脂 95%乙醇提取物对酪氨酸酶有明显的激活作用2,对黑素细胞的迁移和粘附也有明显的促进作用3。本实验采用体外培养的 A375 人黑素瘤细胞作为模型,研究补骨脂含药血清对 A375 人黑素瘤细胞增殖及黑素含量的影响,进一步探讨其药用机制。1 实验材料1.1 药物补骨脂,新疆华康制药公司提供。1.2 试剂与仪器A375 人黑素瘤细胞由上海中国科学院细胞库提供。DMEM (GIBCO),MTT(Amresco),CO2 培养箱(SANYAO),酶标仪(BIO-RAD)等。1.3 动物SD 大鼠 24 只,雄性,体重

6、(20020)g,新疆自治区疾病控制中心实验动物中心提供,许可证号：SYXK(新)2003- 0003。2 实验方法2.1 分组、给药及含药血清制备4-5按完全随机化设计方案,将 24 只大鼠分为 4 组,每组 6 只。药物粉末过 100 目筛制备为 CMC-Na 混悬剂。具体分组给药操作如下：正常对照组灌胃生理盐水；补骨脂低(0.038 g/d)、中(0.19 g/d)、高(0.38 g/d)剂量组每日分 2 次灌胃,连续给药 3 d,正常饮食饮水。末次给药后 23 h腹主动脉无菌取血,分离血清,0.22 m 微孔滤膜除菌,-20 保存备用。2.2 A375 细胞的培养含 10%胎牛血清的

7、DMEM 高糖培养基培养6。2.3 细胞增殖测定采用 MTT 法测定7。每次实验取同一传代细胞,取对数生长期 A375细胞,0.25%胰酶消化 3 min,0.4%台盼蓝计数。使用含 10%胎牛血清的完全 DMEM 培养基调整细胞浓度为 5104/mL,接种于 96 孔板,每孔 100 L。5% CO2 培养箱中 37 培养 24 h。弃去培养基,加入 3 个剂量不同浓度的含药血清培养液 100 L,对照组加入 100 L 的 10%空白血清培养液继续培养 48 h。48 h 后,加 5 mg/mL MTT 20 L/孔,37 、5%CO2培养 4 h 后弃上清,加入 DMSO 150 L,震

8、荡 10 min 左右。立即于 490 nm 测定吸光度值。用吸光度值(OD)表示细胞增殖活性。2.4 黑素生成测定采用 NaOH 法测定7-8,并稍加改动。细胞培养方法和分组方法同上。放入 5%CO2 培养箱中 37 继续培养 48 h 后,弃去培养基,PBS 液洗 2 遍。加入 1 mol/L NaOH 100 L/孔,37 放置 24 h；于 490 nm 测定吸光度值。用吸光度值(OD)表示黑素含量。3 统计学方法实验结果以xs 表示,组间差异的显著性检验采用 SPSS10.0 软件进行方差分析,用 t 检验,以 P0.05 为差异有统计学意义。x【摘要】 目的 探讨含补骨脂大鼠血清对

9、 A375 细胞增殖及合成黑素功能的影响。方法 体外培养 A375 人黑素瘤细胞,于对数生长期添加不同浓度含补骨脂大鼠血清,分别采用 MTT 法和 NaOH 法检测细胞增殖及合成黑素的情况。 结果 补骨脂高、中、低剂量含药血清组较空白血清组有明显促增殖作用,在 20%的添加浓度时,高、中、低 3 个剂量含药血清组随着剂量的增加,黑素含量也明显升高(P0.01)。结论 补骨脂含药血清有促进 A375 黑素瘤细胞增殖作用,并使 A375 人黑素瘤细胞合成黑素增加。 【关键词】 补骨脂；含药血清；黑素合成；细胞增殖Effect of Psoralea on Proliferation and Mel

10、anogenesis in A375 Human Melanoma Cell TANG Xiao-qin1, YAN Ming2, GAO Li2, et al(Pharmacy College of Shihezi University, Shihezi 832000, China；Xinjiang Institute of Traditional Uighur Medicine, Urumqi 830049, China)Abstract：Objective To study the effects of serum containing Psoralea on proliferation

11、 and melanogenesis in A375 human melanoma cells by serum pharmacological method. Method A375 human melanoma cells were cultured in vitro. Different concentrations of drug-contained serum were added to the culture medium during logarithmic growth phase. Melanocyte culture was determined by MTT and Na

12、OH method. Results There was a significant difference between the control and the drug-contained serum test group on proliferation, and there was significant increase in 20% serum drug-contained serum on melanogenesis (P0.01). Conclusion Serum containing Psoralea has strong effect of promoting A375

13、human melanoma cells proliferation and melanogenesis in vitro. Key words：Psoralea；drug contained serum；melanogenesis；cell proliferation补骨脂为豆科植物补骨脂 Psoralea corylifolia L.的果实,性味辛、苦、温,归肾、脾经1,具有温肾助阳、纳气、止泻功效。历代中医常用于治疗肾虚、遗尿、泄泻、白癜风、秃发。研究发现,补骨脂 95%乙醇提取物对酪氨酸酶有明显的激活作用2,对黑素细胞的迁移和粘附也有明显的促进作用3。本实验采用体外培养的 A375 人

14、黑素瘤细胞作为模型,研究补骨脂含药血清对 A375 人黑素瘤细胞增殖及黑素含量的影响,进一步探讨其药用机制。1 实验材料1.1 药物补骨脂,新疆华康制药公司提供。1.2 试剂与仪器A375 人黑素瘤细胞由上海中国科学院细胞库提供。DMEM (GIBCO),MTT(Amresco),CO2 培养箱(SANYAO),酶标仪(BIO-RAD)等。1.3 动物SD 大鼠 24 只,雄性,体重(20020)g,新疆自治区疾病控制中心实验动物中心提供,许可证号：SYXK(新)2003- 0003。2 实验方法2.1 分组、给药及含药血清制备4-5按完全随机化设计方案,将 24 只大鼠分为 4 组,每组 6

15、 只。药物粉末过 100 目筛制备为 CMC-Na 混悬剂。具体分组给药操作如下：正常对照组灌胃生理盐水；补骨脂低(0.038 g/d)、中(0.19 g/d)、高(0.38 g/d)剂量组每日分 2 次灌胃,连续给药 3 d,正常饮食饮水。末次给药后 23 h腹主动脉无菌取血,分离血清,0.22 m 微孔滤膜除菌,-20 保存备用。2.2 A375 细胞的培养含 10%胎牛血清的 DMEM 高糖培养基培养6。2.3 细胞增殖测定采用 MTT 法测定7。每次实验取同一传代细胞,取对数生长期 A375细胞,0.25%胰酶消化 3 min,0.4%台盼蓝计数。使用含 10%胎牛血清的完全 DMEM

16、 培养基调整细胞浓度为 5104/mL,接种于 96 孔板,每孔 100 L。5% CO2 培养箱中 37 培养 24 h。弃去培养基,加入 3 个剂量不同浓度的含药血清培养液 100 L,对照组加入 100 L 的 10%空白血清培养液继续培养 48 h。48 h 后,加 5 mg/mL MTT 20 L/孔,37 、5%CO2培养 4 h 后弃上清,加入 DMSO 150 L,震荡 10 min 左右。立即于 490 nm 测定吸光度值。用吸光度值(OD)表示细胞增殖活性。2.4 黑素生成测定采用 NaOH 法测定7-8,并稍加改动。细胞培养方法和分组方法同上。放入 5%CO2 培养箱中

17、37 继续培养 48 h 后,弃去培养基,PBS 液洗 2 遍。加入 1 mol/L NaOH 100 L/孔,37 放置 24 h；于 490 nm 测定吸光度值。用吸光度值(OD)表示黑素含量。3 统计学方法实验结果以xs 表示,组间差异的显著性检验采用 SPSS10.0 软件进行方差分析,用 t 检验,以 P0.05 为差异有统计学意义。4 结果4.1 补骨脂含药血清对 A375 黑素瘤细胞增殖的影响结果显示,随着添加浓度的增加,含药血清组和空白血清组对细胞增殖的促进作用也逐渐增加,含药血清浓度为 5%时,高、中、低各剂量组均未呈现出增殖作用。在 10%的血清添加浓度时,低、中剂量含药血

18、清对A375 细胞有明显的促增殖作用；在 20%的血清添加浓度时,中、高剂量含药血清对 A375 细胞均有明显的增殖作用；在 30%的血清添加浓度时,低、中剂量含药血清明显促进 A375 细胞的增殖。结果见表 1。表 1 补骨脂含药血清对 A375 人黑素瘤细胞增殖的影响(略)4.2 补骨脂含药血清对 A375 人黑素瘤细胞黑素含量的影响与正常对照组比较,在 20%的添加浓度时,高、中、低 3 个剂量组含药血清随着剂量的增加,黑素含量也明显升高(P0.01),呈剂量依赖性；在30%的添加浓度时,仅高剂量组的黑素生成量与空白血清组比较差异有统计学意义。结果见表 2。表 2 补骨脂含药血清对 A3

19、75 人黑素瘤细胞黑素含量的影响(略)5 讨论血清药理学是近年来建立和发展起来的一种适合于体外研究中药药理的新方法,主要是通过研究给药动物血清的生物学活性来揭示药物作用机理。鉴于药物在动物体内代谢是一个复杂的过程,本实验设置了多个采血时间点,发现给药 23 h 后药物血清表现出更强的促细胞增殖作用,而6 h 后药物活性显著降低,促细胞增殖作用减弱。大量实验表明,血清灭活与否要依据不同的药物而定,韩氏9认为,最好选用未灭活的血清,这样既可全面反映中药的作用机理,又与体内实验和临床用药情况相符。本实验还比较了灭活血清和未经灭活的血清对 A375 人黑素瘤细胞增殖的影响,发现未经灭活的含药血清药效更

20、明显,故选用未经灭活的血清用于实验。本实验应用 MTT 比色分析和 NaOH 法检测补骨脂含药血清对 A375 人黑素瘤细胞增殖和黑素合成的影响,结果显示,补骨脂不仅能显著促进A375 人黑素瘤细胞增殖,还能显著促进黑素的合成。黑素合成是个复杂的过程,有研究发现,补骨脂对豚鼠皮肤酪氨酸酶 mRNA 表达有显著的促进作用10,而李氏等11的研究表明,补骨脂对体外培养的黑素细胞酪氨酸酶基因蛋白的表达有抑制作用,故补骨脂促进黑素合成的途径是促进酪氨酸酶蛋白表达还是提高其活性有待进一步研究。促进黑素合成的还有多种信号途径,目前研究的较为清楚的有二脂酰甘油/蛋白激酶 C 途径、一氧化氮/环磷酸鸟苷/蛋白

21、激酶 G 途径、环磷酸腺苷/蛋白激酶 A 途径和丝裂原激活的蛋白激酶级联途径12。补骨脂对黑素生成的促进作用究竟是通过哪个环节和途径需要继续深入研究。【参考文献】1 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)S.北京：化学工业出版社,2005.129.2 徐建国,尚 婧.补骨脂对酪氨酸酶的激活作用J.中草药,1991,22(4)：168.3 牟宽厚,张宪旗,余 兵,等.补骨脂对体外黑素细胞黏附和迁移的作用J.中国中药杂志,2004,29(4)：346348.4 崔 玲,高天文,党育平,等.含中药血清对体外黑素细胞增殖及黑素合成量的影响J.中国皮肤性病学杂志,2005,19(1)：1921.5

22、杨彦芳,王玉芹.中药复方血清药理学方法规范化探讨J.中国中西医结合杂志,2000,20(5)：380.6 邓瑞春,周 勇,章金刚,等.驱虫斑鸠菊对人黑素瘤细胞增殖酪氨酸酶及黑素生成影响的研究J.生物通讯技术,2002,13(2)：135137.7 刘志军,刘 晶,张焕梅.消白合剂对人 A375 黑素瘤细胞株黑素合成的影响J.上海中医药杂志,2009,43(1)：8183.8 邓瑞春,周 勇,章金刚,等.驱虫斑鸠菊对 B-16 黑素瘤细胞酪氨酸酶活性及黑素生成影响J.氨基酸和生物资源,2002,24(1)：3132.9 韩 俭.中药血清药理学方法学研究抗菌试验含药血清处理方案的研究J.中药药理与临床,2002,18(1)：4748. 10 涂彩霞,刘亚玲,马景昕.旱莲草等中药对皮肤酪氨酸酶 mRNA 表达的影响J.中华临床医药,2005,5(4)：911.