藏药十八味诃子利尿丸抗菌性研究.doc

1、藏药十八味诃子利尿丸抗菌性研究作者：傅永红， 李红玉， 张春江， 员田 【关键词】 十八味诃子利尿丸；,抑菌活性；,最小抑菌浓度摘要：目的研究藏药十八味诃子利尿丸体外抑菌活性。方法用琼脂扩散法和微量稀释法研究其抑菌圈和最小抑菌浓度（MIC） 。结果十八味诃子利尿丸具有抑制金黄色葡萄球菌、耐药表皮葡萄球菌、非耐药表皮葡萄球菌、粪肠球菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单孢杆菌、白色念珠菌的生长繁殖的活性，另外不同溶剂解药品抑菌性有一定差异。结论十八味诃子利尿丸对临床分离的白色念珠球菌和耐药表皮葡萄球菌有较强的抑制作用，具有较高的临床应用价值。 关键词：十八味诃子利尿丸； 抑菌活性；

2、 最小抑菌浓度Abstract：ObjectiveTo investigate the inhibitory effects of Shibawei Heziliniao pill on microbe in vitro.MethodsInhibition zone and minimum inhibitory concentration (MIC) were examined by using MH agar plates ,PDA agar plates and minidilution.ResultsIt was shown that Shibawei Hezilinao pill ha

3、s strong bacteriostasis inhibition to the growth of Staphlococcus aureus ATCC25923,Escherichia coli ATCC25922,Pseudomonas aeruginosa ATCC2785,Bacillus subtilis, methicillinresistant Staphylococcus epidermidis ,Candida albicans,methicillinsensitive Staphylococcus aureus,Bacillus cereus,Enterococccus

4、faecalis,besides the inhibitory effect of microbe were different when Shibawei pill was extracted with different solution. ConclusionShibawei Heziliniao pill has obvious antibacterial activity to clinically isolated strains Candida albicans and methicillinresistant Staphylococcus epidermidis,thus it

5、 is possible to be applied to clinical therapy.Key words：Shibawei Heziliniao pill; Antibacterial activity; MIC近年来细菌性感染疾病日渐增长，细菌耐药性问题已成为 21 世纪全球关注的热点1 。大多数现代抗菌药物活性成分单一，并且存在开发难成本高耗时长等困难。为此国内外很多学者都把目标转向对人体毒副作用小，易于代谢，且不易产生耐药性的中草药。藏医药学是中国医药学宝库中的璀璨明珠，具有悠久的历史和丰富的蕴藏。藏药大多取材于高原地区的动植物和矿物石。这些药材资源长期生存于高原地理环境，促进了

6、其体内具有特有的多种次生代谢产物的生长和复杂矿物的形成2 。这些物质往往具有独特的抗菌功效，因此藏药是具有广阔前景的抗菌研究新生方向的药物。十八味诃子利尿丸是传统的藏药复方，主要成分为诃子（去核） 、红花、豆蔻、余甘子、姜黄、小檗皮、蒺藜、金门石、刺柏、刀豆、熊胆、人工牛黄等 18 味，有益肾固精、利尿的功效。用于肾病、腰肾疼痛、尿频、小便浑浊、糖尿病等症的临床治疗3 。其中诃子（去核） 、豆蔻、余甘子、姜黄、小檗皮、蒺藜、刺柏、人工牛黄等具有一定的清热解毒、抑制病毒的作用4 。清热解毒药物属中医祛邪疗法之一，这类药物多用于恶性肿瘤热证、实证、瘟病时疫等5 。现代中药药理研究表明：清热解毒类药

7、一般具有较广的抗菌谱，能抑制病毒，提高机体非特异性免疫力，对肿瘤细胞有抑制作用，具有消炎止痛、杀菌、抑癌、排毒和退热等作用。藏药生境独特，药理功效强，其临床疗效引起国内外的关注和日益重视6 。目前对藏药的药理研究很少，对清热解毒复方的体外抑菌作用基本没有研究报道。为了探讨藏药复方十八味诃子利尿丸发挥药理作用的机理，阐明该药益肾利尿的作用机制以充分开发其药物利用价值，我们进行了十八味诃子利尿丸体外抗菌实验研究。现将结果报告如下。1 材料与方法1.1 药品十八味诃子利尿丸由甘肃省甘南藏族自治州佛阁藏药有限公司提供，药品批号 050801。1.2 菌种标准菌株：金黄色葡萄球菌（Staphylococ

8、cus aureus）ATCC25923，大肠杆菌（Escherichia coli)ATCC25922，铜绿假单孢杆菌（Pseudomonas aeruginosa）ATCC2785。临床分离菌株：枯草芽炮杆菌（Bacillus subtilis） ，蜡状牙孢杆菌（Bacillus cereus） ，耐药表皮葡萄球菌（methicillinsesistant Staphylococcus epidermidis)，白色念珠菌（Candida albicans） ，非耐药表皮葡萄球菌（methicillinsensitive Staphylococcus aureus）,粪肠球菌（Entero

9、coccus faecalis） 。以上菌株均由甘肃省临床检验中心提供。1.3 培养基 MH 琼脂培养基、PDA 培养基、牛肉膏蛋白胨培养基（购于中国药品生物制品鉴定所） 。1.4 药液的制备分别用 100%DMSO，50%DMSO 和无菌水溶解十八味诃子利尿丸并配制药品浓度为 100，50，10 mgml-13 个梯度。1.5 菌液制备取实验菌种于 1 ml 无菌始菌悬液中，吹打均匀；菌悬液 a：吸取初始菌悬液 50 l 于 950 l 生理盐水中混匀，调节菌液浓度为 106CFU（colony forming unit，CFU）/ml，用于抑菌圈测定；菌悬液 b：吸取初始菌悬液 500 l

10、 于 10 ml 牛肉膏蛋白胨中培养基中，调节菌液浓度为 106CFU（collonyforming unit ,CFU）/ml，用于最小抑菌浓度（MIC）的测定。1.6 抑菌圈测定无菌条件下取菌悬液 a 200 l 滴加于 MH 琼脂培养基和 PDA 培养基（用于白色念珠菌）表面，涂布均匀，放置牛津杯，待菌液浸入且牛津杯吸附后加 100 l 用 100%DMSO，50%DMSO 和无菌水溶解浓度为 100，50，10 mgml-1 的十八味诃子利尿丸药样于牛津杯中，置 37培养箱培养 24 h（白色念珠球菌 30培养 48 h） ，测定抑菌直径 DD。1.7 最小抑菌浓度（MIC）的测定 9

11、6 孔细胞培养板中每孔加 100 l 菌悬液 b ，然后分别用 100%DMSO，50%DMSO 和无菌水溶解的浓度为100 mgml-1 的药品采用倍比稀释法稀释至50，25，12.5，6.25，3.125，1.56，0.78，0.39，0.195，0.098，0.049，0.024 5 mgml-112 个浓度梯度，置 37培养箱 24 h（白色念珠球菌 30培养 48 h） ，测定最小抑菌浓度（MIC） 。1.8 数据处理实验数据均为 3 次平行实验结果的平均值。2 结果2.1 十八味诃子利尿丸抑菌圈结果实验以金黄色葡萄球菌、耐药表皮葡萄球菌、非耐药表皮葡萄球菌、粪肠球菌、枯草芽孢杆菌、

12、蜡状芽孢杆菌等代表革兰氏阳性（G+）菌，以大肠埃希菌、铜绿假单孢杆菌代表革兰氏阴性（G-）菌，白色念株菌代表真菌7对十八味诃子利尿丸进行体外抑菌药理活性的初步研究。结果见表 1。对表 1 中数据分析可得：十八味诃子利尿丸具有抑制金黄色葡萄球菌、耐药表皮葡萄球菌、非耐药表皮葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽球菌、大肠埃希菌、铜绿假单孢杆菌和白色念株菌的生长繁殖的活性，均形成直径 819 cm 的抑菌圈；其中在相同的溶剂条件下浓度越大抑菌圈直径越大，如表 1 中所示以 100%DMSO 为溶剂，药液浓度为 100 mgml-1 与药液浓度为50 mgml-1 时所形成的抑菌圈直径差距为 16 cm,药

13、液浓度为50 mgml-1 与药液浓度为 10 mgml-1 时所形成的抑菌圈直径差距为 07 cm。对比不同溶剂溶解药品形成的抑菌圈得到100%DMSO 溶解药品所产生的抑菌圈直径最大，表明其抑菌效果最好，50%DMSO 的抑菌效果次之，无菌水溶解药品抑菌效果最弱。比较革兰氏阳性（G+）菌和革兰氏阴性（G-）菌，对以金黄色葡萄球菌、耐药表皮葡萄球菌、非耐药表皮葡萄球菌、粪肠球菌、大肠埃希菌等泌尿系统感染主要致病菌的抑制能力较强。对通常抗生素难抑制的白色念珠菌效果较好，表 1 中 9 号白色念珠菌以 100%DMSO 为溶剂药液浓度为 100 mgml-1 时抑菌圈直径可达 19 mm。表 1

14、 十八味诃子利尿丸抑菌菌圈结果（略）+：阳性对照细菌用浓度均为 40 gml-1 左氧氟沙星，白色念珠菌用浓度均为 200 gml-1 氟康唑；-：阴性对照用100%DMSO2.2 十八味诃子利尿丸最小抑菌浓度（MIC）结果见表 2。表 2 十八味诃子利尿丸最小抑菌浓度（MIC）结果（略）通过对表 2 中数据分析可得,十八味诃子利尿丸对金黄色葡萄球菌、耐药表皮葡萄球菌、非耐药表皮葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌、大肠埃希菌、铜墙铁壁绿假单孢杆菌和白色念珠菌的生长繁殖具有一定的抑制活性，MIC 为 3.12550 mgml-1。总体对比革兰氏阳性（G+）菌和革兰氏阴性（G-）菌的 MIC，以金黄

15、色葡萄球菌、耐药表皮葡萄球菌、非耐药表皮葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、粪肠球菌为代表革兰氏阳性（G+）菌的 MIC 范围在 3.12512.5 mgml-1，而以大肠埃希菌、铜绿假单孢杆菌为代表革兰氏阴性（G-）菌的 MIC范围在 12.525 mgml-1，MIC 越小说明抑制性越强，由此可见十八味诃子利尿丸对革兰氏阳性（G+）菌的抑制效应更显著一些。十八味诃子利尿丸对金黄色葡萄球菌、耐药表皮葡萄球菌、非耐药表皮葡萄球、菌粪肠球菌、大肠埃希菌泌尿系统感染主要致病菌的抑制体总体比较显著。对通常抗生素难抑制的耐药菌和真菌效果较好，如表 2 中所示5 号耐表皮葡萄菌和 9 号白色念珠菌 1

16、00%DMSO 溶解药品 MIC 达到 3.125 mgml-1，50%DMSO 溶解药品 MIC 达到 6.25 mgml-1，均为各种菌种 MIC 最小值。对比不同溶剂溶解药品的 MIC 得到 100%DMSO 溶解药品所生的 MIC 为 3.12512.5 mgml-1，50%DMSO 溶解药品所产生的 MIC 为 6.2550 mgml-1，无菌水溶解药品所产生的MIC 均为 50 mgml-1，可见 100%DMSO 的抑菌效果次之，无菌水溶解药品抑菌效果最弱。3 讨论泌尿系统感染为常见感染性疾病，具有“顽固性”和迁延性，临床有特效且副作用小的药物比较少见8 ，因此，寻找对泌尿系统感

17、染有特效且副作用小的药物，成为国内外学者追逐的热点。十八味诃子利尿丸是藏区上百年长期临床应用的复方，以清热解毒、利湿通淋为主，辅助活血化淤、益肾补虚为组方之法，选择地道优质高原上受日照充分、药物活性成分含量高的药材精制而成3 ，同类西药一般是通过抗菌、杀菌的机理实现治疗，通常易在短期产生抗药性，毒副作用的，不宜长期大量服用。与同类中成药相比十八味诃子丸采用的药材一般生长在 3 500 m 以上的高原，日照充分、药物活性含量高、易于体内吸收4 。据多年临床验证，该药具有见效快、疗程短、治愈率高、不易复发等特点，药品价格性能均具有明显优势。实验首次从其清热解毒的药理作用出发对十八味诃子利尿丸进行体

18、外抑菌活性研究，实验表明十八味子利尿丸对金黄色葡萄球菌、耐药表皮葡萄球菌、非耐药表皮葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、粪肠球菌、大肠埃希菌、铜绿假单炮菌和白色念珠菌的生长繁殖都具有一定的抑制作用，抗菌谱较广。许多病原微生物都能通过不同途径侵入泌尿系统引起各种感染性疾患。临床常见泌尿系统感染性疾患可由多种固紫阴性杆菌（大肠杆菌、副大肠杆菌、产气杆菌等）和某些固紫阳性球菌（葡萄球菌、链球菌等）致病9 。虽然通过实验得到十八味诃子利尿丸对革兰氏阳性（G+）菌比对革兰氏阴性（G-）菌的抑制作用强，但这一点并不与临床病理依据相悖，实验结果表明十八味诃子利尿丸对金黄色葡萄球菌、耐药表皮葡萄球菌、非耐药

19、表皮葡萄球菌、菌粪肠球菌、大肠埃希菌等泌尿系统感染主要致病的抑制性显著，对于其他主要致病菌类的抑制作用有待于进一步研究。在相同溶剂条件下浓度越大抑菌圈直径较大，MIC 越小，抑菌作用越好，可见药品浓度与抑菌效应呈正相关。对比不同溶剂溶解药品的作用得到100%DMSO 溶解药品抑菌效果最好，50%DMSO 的抑菌效果次之，无菌水溶解药品抑菌效果最弱，这可能与有效作用成分为脂溶性有关，通常情况下药物成分具有一定的脂溶性对药物吸收有利10 。值得一提的是通过本次实验得到十八味诃子利尿丸对通常抗生素难抑制的耐药菌和真菌抑制效果较好，尤其是对白色念珠菌抑制效果最好，这一点为临床治疗细菌的耐药性继而产生内

20、源性感染及二重感染和常见由白色念珠菌引起的多种疾病提供新的依据。参考文献：1 陈代杰.抗菌药物与细菌耐药性，第 1 版M.上海：华东理工大学出版社，2001：1.2 刘 忠.试论藏药资源及其开发J.中国民族民间医药杂志，2005，1：11.3 西藏卫生局，青海卫生局，四川卫生局，等.藏药标准S.西宁：青海人民出版社，1979：146.4 青海省藏医药研究所青海省药品检验所.中国藏药（第 1卷，第 2 卷，第 3 卷） M.上海：科学技术出版社，1996：589.5 沈映君.中药药理学M.北京：人民卫生出版社，2000：180.6 Huang,M.B.,Internet resources for Tibetan medicineJ.Medical reference services quarterly.2001,20:61.7 中国科学院微生物研究所伯杰细菌鉴定手册翻译组.伯杰细菌鉴定手册，第 8 版M.北京：科学出版社，1984：1533.8 吕仁和，王秀琴，陈莲卿，等.泌尿系感染的中医调治M.北京：人民卫生出版社，1987：1.9 河北新医大学赤脚医生参考从书编写组.基础医学问答 9泌尿系统M.北京：人民卫生出版社，1978：104.10 魏树礼，张 强.生物药剂学与药物动力学M.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1997：3.