超高分子量聚乙烯和氧化锆颗粒对兔膝关节周围组织的影响.doc

1、超高分子量聚乙烯和氧化锆颗粒对兔膝关节周围组织的影响【摘要】 目的 观察大颗粒超高分子量聚乙烯(UHMWPE)和氧化锆(zirconia)对兔膝关节周围组织炎症细胞因子表达的差异和组织学改变,并初步探讨其作用机制。方法 日本大耳白兔 45 只,随机分为 UHMWPE 颗粒组、氧化锆颗粒组和对照组,每组 15 只。兔右侧膝关节腔及关节内侧组织分别注入平均直径为 58.87 m 的 UHMWPE 颗粒混悬液（UHMWPE 颗粒组）或氧化锆颗粒混悬液(氧化锆颗粒组)，颗粒浓度均为 0.1%（V/V)；对照组只注入等量无菌磷酸盐缓冲液，其余条件均与 UHMWPE 颗粒组及氧化锆颗粒组相同。分别于实验第

2、 8、16、24 周取膝关节周围组织，进行病理组织学检查，ELISA 法检测标本组织中 IL-1、IL-6、TNF- 的变化。结果 与对照组相比，UHMWPE 颗粒组可见颗粒周围有大量巨噬细胞、多核巨细胞与成纤维细胞包绕,外周形成纤维膜；而在氧化锆颗粒组,第8 周时颗粒周围未见巨噬细胞、多核巨细胞和成纤维细胞,第 16 周开始出现少量上述细胞,第 24 周时细胞数增加,但仍然少于 UHMWPE 颗粒组。实验第 8、16、24 周,UHMWPE 颗粒组 IL-1、IL-6、TNF- 的表达均明显高于氧化锆颗粒组和对照组（P0.05） 。氧化锆颗粒组 IL-1、IL-6、TNF- 的表达在第 8、

3、16 周组时与对照组比较差异无统计学意义（P0.05）,第 24 周 3 种细胞因子均明显高于对照组(P0.05)。结论 在不能被巨噬细胞吞噬的大颗粒中, UHMWPE 颗粒的生物活性仍然较氧化锆颗粒强, 由此推测 UHMWPE 颗粒导致假体周围骨质溶解的反应要强于氧化锆颗粒。 【关键词】 关节假体材料 人工关节 超高分子量聚乙烯 氧化锆 细胞因子 Abstract:Objective To observe the differences between ultra-high molecular weight polyethylene (UHMWPE) and the zirconia par

4、ticles on the expression of inflammatory cytokines and histological changes of the peripheral tissues of knee joint in rabbits and to make a preliminary probe into the underlying mechanisms.Methods 45 Japanese white rabbits were randomly divided into three groups (n=15 each): UHMWPE particle group,

5、zirconia particle group and control group. Suspension of UHMWPE particles or zirconia particles of 58.87 m in average diameter at volume percent of 0.1% concentration was injected into the knee joint capsules and the medial tissues on the right side in rabbits. Control group only received the same a

6、mount of sterile phosphate buffer under the same condition as UHMWPE group and zirconia particle group. Peripheral tissues of knee joint were examined for pathohistological assessment and ELISA was performed for changes of the three cytokines (IL-1, IL-6 and TNF-) at the 8th, 16th and 24th week afte

7、r particle injection, respectively.Results Compared with the control group, in the UHMWPE particle group, the particles were surrounded by the tunica fibrosa. Optical microscopy indicated that the UHMWPE particles were surrounded by numerous macrophages, multinucleated giant cells and fibroblasts, w

8、hich formed a tunica fibrosa in the peripheral tissue; while in the zirconia particle group, there were no macrophages, multinucleated giant cells, fibroblasts around zirconia particles at the 8th week after injection, and a scant number of the above cells emerged from the 16th week and the cell cou

9、nt increased at the 24th week but was still lower than in the UHMWPE particle group. The expression levels of IL-1, IL-6 and TNF- were in the UHMWPE particle group were markedly higher than in the control and zirconia particle groups (P0.05) at 8th, 16th and 24th week after injection, but still was

10、less than UHMWPE particle group. The expression levels of IL-1, IL-6 and TNF- in the zirconia particle group at 8th week and 16th week had no statistic significance compared with the control group (P0.05). The levels of inflammatory cytokines of zirconia particle group at 24th week were markedly hig

11、her than the control group (P0.05).Conclusion Of the macroparticles that can not be devoured by macrophages, UHMWPE particles have much stronger biological activity than zirconia particles. Thus an inference might be made that UHMWPE particles are capable of inducing a stronger osteolysis in the per

12、ipheral tissue of prosthesis than zirconia particles in conditions with equal particle volume. Key words: materials for joint prosthesis; artificial joint; ultra-high molecular weight polyethylene; zirconia; cytokine 在造成人工关节无菌性松动的诸多因素中,磨损颗粒引起的生物学反应正日益受到重视。磨损颗粒被局部的吞噬细胞，特别是巨噬细胞吞噬后，激活吞噬细胞并释放一系列炎症因子，如 I

13、L-1、IL-6、TNF- 和PGE2 等，这些炎症因子又作用于破骨细胞，导致骨质溶解、人工关节假体松动1-2 。目前应用于人工关节假体的材料有许多种，超高分子量聚乙烯(ultra-high molecular weight polyethylene, UHMWPE)是临床上较为常用的假体材料, 金属对 UHMWPE 假体，即金属关节头和聚乙烯臼杯相关节，也是当前最流行的假体配伍方式,但是仍然不能避免聚乙烯磨损颗粒的产生3 。氧化锆(zirconia)为惰性生物陶瓷的一种,在生物体内与组织几乎不发生反应或反应很小,成为人工关节假体的新型材料4 。临床组织学观察发现，不同材质的颗粒诱发骨溶解的强

14、弱程度不同，在可被巨噬细胞吞噬范围(12 m)的颗粒中,以 UHMWPE 颗粒的生物活性作用最强,且颗粒越小激活巨噬细胞的作用越明显5,但对不能被吞噬的较大磨损颗粒造成局部生物学反应的差异尚不明了，也缺乏相关实验研究。本实验选择了 UHMWPE 和氧化锆这 2 种较大、不能被巨噬细胞吞噬的颗粒,通过对比观察它们引起生物学反应的差异,探讨其可能的原因。 1 材料和方法 1.1 实验动物、材料和分组 日本大耳白兔 45 只，57 月龄，雌雄各半，体重 2.53.0 kg，由徐州医学院实验动物中心提供。UHMWPE颗粒和氧化锆颗粒由中国矿业大学材料研究院提供，经扫描电镜（SEM）检测其形状基本为球形

15、，平均直径为(58.876.31) m。按随机原则将实验动物分为 3 组：UHMWPE 颗粒组、氧化锆颗粒组及对照组，每组 15 只。每组分别取第 8、16、24 周 3 个时间点，每一个时间点每组取实验动物5 只进行实验。 1.2 实验方法 参阅有关文献5-6 ，将 UHMWPE 颗粒和氧化锆颗粒用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）配成体积分数为 0.1%的混悬液。2.5%戊巴比妥钠溶液 25 mgkg-1 耳缘静脉麻醉成功后，均选择右侧膝关节，局部备皮消毒，推开髌骨，注入膝关节腔内 UHMWPE 颗粒(UHMWPE 颗粒组)或氧化锆颗粒（氧化锆颗粒组）混悬液 2 ml 及膝关节内侧组织 1 ml，

16、注入后再次局部消毒并按压 5 min 以防外溢。对照组注入等量的无菌 PBS。整个操作过程严格遵循无菌原则。术毕将兔单笼饲养，不制动。 1.3 标本采集与观察指标 术后观察实验动物一般情况、下肢活动及注射部位皮肤的情况。分别于第 8、16、24 周用空气栓塞法处死动物，立即取膝关节周围组织，置于 10中性甲醛溶液（pH 7.27.4）,常温下固定 24 h。石蜡切片，苏木精-伊红常规染色，光镜下观察兔膝关节周围组织对 UHMWPE 颗粒和氧化锆颗粒产生的组织学反应。在相同时间取部分膝关节周围组织 3 g，用组织剪将其剪碎，加生理盐水 3 ml，用匀浆器彻底匀浆，取匀浆液 2 ml，以 8000

17、 r/min 离心 10 min,留取上清液1.0 ml,于-80下保存。ELISA 法检测标本组织中细胞因子，包括 IL-1、IL-6、TNF-。试剂盒购自碧云天生物工程公司（进口分装） ，严格按照试剂盒说明的步骤进行操作。 1.4 统计学处理 数据采用s 表示，应用 SPSS 11.5 统计软件进行数据处理。组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）,组间两两比较应用 q 检验。P0.05 为差异有统计学意义。 2 结 果 2.1 病理检查结果 2.1.1 UHMWPE 颗粒组 苏木精-伊红染色光镜下表现为：注入UHMWPE 颗粒后第 8 周，可见乳白色的 UHMWPE 颗粒形状完整,周围包

18、裹少许多核巨细胞和成纤维细胞,未见中性粒细胞和淋巴细胞（图 1A） 。第 16周时, 可见 UHMWPE 颗粒周围被大量巨噬细胞、多核巨细胞、成纤维细胞所包绕，多核巨细胞数量最多,淋巴细胞极少,未见中性粒细胞（图 1B） 。第 24 周时, 这种包裹明显变厚，细胞数量显著增加，外层有纤维组织增生（图 1C） 。 图 1 UHMWPE 颗粒组不同时间的病理组织学改变(苏木精-伊红染色,400) A.第 8 周；B.第 16 周；C.第 24 周 2.1.2 氧化锆颗粒组 注入氧化锆颗粒后的第 8、16、24 周,均可见氧化锆颗粒形态基本完整,有断裂的痕迹。第 8 周时颗粒周围未见到明显的巨噬细胞

19、、多核巨细胞、成纤维细胞及中性粒细胞（图 2A） 。第 16周时,可见氧化锆颗粒周围开始包裹少许巨噬细胞、成纤维细胞,但远较同期 UHMWPE 颗粒周围包裹的细胞数少（图 2B） 。到第 24 周时,可见氧化锆颗粒周围包裹 23 层多核巨细胞、成纤维细胞,外层有少许纤维组织增生（图 2C） 。 2.1.3 对照组 注入 PBS 后第 8、16 和 24 周,对照组关节周围组织未见 UHMWPE 颗粒或氧化锆颗粒,未见多核巨细胞、成纤维细胞等（图 3 A、B、C） 。 图 2 氧化锆颗粒组不同时间的病理组织学改变(苏木精-伊红染色,400) A.第 8 周；B.第 16 周；C.第 24 周 图

20、 3 对照组不同时间的病理组织学改变(苏木精-伊红染色,100) A.第 8 周；B.第 16 周；C.第 24 周 2.2 细胞因子的检测结果 注入 UHMWPE 颗粒后第 8、16、24 周, IL-1、IL-6 和 TNF- 均有明显增高,明显高于同期的氧化锆颗粒组和对照组(P0.05)，且随着时间延长,表达明显增加。氧化锆颗粒组 IL-1、IL-6 和 TNF- 在第 8、16 周时表达极低,与对照组相比差异无统计学意义（P0.05） ；到第 24 周时,细胞因子表达比对照组明显增加(P0.05) 。见表 13。表 1 3 组不同时间 IL-1 表达水平的比较 与对照组比较：*P0.0

21、5;与氧化锆颗粒组比较：P0.05 表 2 3组不同时间 IL-6 表达水平的比较 与对照组比较：*P0.05;与氧化锆颗粒组比较：P0.05 表 3 3组不同时间 TNF- 表达水平的比较与对照组比较：*P0.05;与氧化锆颗粒组比较：P0.05 3 讨 论 3.1 UHMWPE 颗粒是激活巨噬细胞并促进其释放炎症细胞因子的主要颗粒 临床组织学观察已表明,人工关节假体周围最常见、数量最多的磨损颗粒为 UHMWPE 颗粒。UHMWPE 颗粒可激活巨噬细胞，使其聚集到颗粒周围并被其吞噬,吞噬颗粒后的巨噬细胞进一步被激活,分泌一系列化学介质和细胞因子, 包括IL-1、IL-6、TNF-、PGE2

22、和基质金属蛋白酶(MMPs)等,抑制成骨细胞活性,同时激活破骨细胞促进骨吸收,是引起骨质溶解、关节松动的最主要原因2,7 。 UHMWPE 颗粒直径越小生物活性越强,超过巨噬细胞吞噬范围(15 m)的磨损颗粒活性较弱。本实验以不能被巨噬细胞吞噬的大颗粒为研究对象,向动物实验模型关节腔注射平均直径为 58.87 m 的UHMWPE 颗粒和氧化锆颗粒，结果显示,异物巨细胞、巨噬细胞和成纤维细胞均不能将其吞噬。UHMWPE 组的颗粒周围可见大量巨噬细胞、多核巨细胞和成纤维细胞包裹,并随时间延长包裹现象不断加强,在颗粒周围形成纤维膜；而对照组未见到巨噬细胞、多核巨细胞和成纤维细胞；氧化锆颗粒组在第 1

23、6 周时才可见其周围包裹少许多核巨细胞和成纤维细胞。此结果证明即使不能被巨噬细胞吞噬的 UHMWPE 颗粒仍然具有较强的生物活性,其对巨噬细胞的激活作用仍然强于氧化锆颗粒。炎症细胞因子(IL-1、IL-6 和 TNF-)的检测结果表明, UHMWPE 颗粒组随时间延长细胞因子分泌逐渐增加, 显著高于同期的氧化锆颗粒组和对照组,也说明较大的UHMWPE 颗粒在导致人工关节假体松动的发病过程中起一定作用。分析其可能的机制，在 UHMWPE 磨损颗粒诱导的炎症反应过程中，除了巨噬细胞外，尚有多种细胞参与，如 T 淋巴细胞、肥大细胞、异物巨细胞、成纤维细胞以及内皮细胞等。除了细胞与异物颗粒相互作用外,

24、这些细胞之间可以相互激活、相互作用，使大颗粒在巨噬细胞无法吞噬的情况下仍然表现出一定的生物活性。既往研究表明, 数量众多是 UHMWPE 颗粒生物活性强、导致骨质松动的主要原因。但本实验显示在体积、数量均相同的条件下, UHMWPE 颗粒本身对巨噬细胞的激活作用仍然较氧化锆颗粒更强、更迅速，产生更多的炎性介质和细胞因子，这从另外一个角度解释了UHMWPE 颗粒较其他颗粒更易诱发骨溶解的原因。 3.2 氧化锆颗粒与 UHMWPE 颗粒生物活性的比较 氧化锆陶瓷因其出色的摩擦学性能、抗破裂强度(burst strength) 和耐腐蚀性而被誉为“金属陶瓷” 。与 UHMWPE 磨损微粒相比，氧化锆

25、磨损微粒数量少和表现为生物学惰性，因此较少引起细胞的炎症反应和骨溶解反应8 。本实验病理组织学检查显示, UHMWPE 颗粒组在第 8 周即可见颗粒周围有异物巨细胞、成纤维细胞等的包裹,并随时间延长包裹逐渐加强,到第 24 周时,可见包裹明显增厚,细胞数显著增多,其外周形成纤维膜增生；而对应的氧化锆颗粒组在第 8 周时未见其周围有巨噬细胞或多核巨细胞的存在,到第16 周时,有少许散在的异物巨细胞、成纤维细胞包裹在其周围,第 24 周时,包裹较前有所增加,但与 UHMWPE 颗粒组相比,包裹层次薄,细胞数量少,表现其生物学惰性。与此相对应的细胞因子检测结果也显示, 在第 8 周和 16周时, 氧

26、化锆颗粒组 IL-1、IL-6 和 TNF- 水平与对照组比较差异无统计学意义,第 24 周时,细胞因子分泌有所增加,但其水平远远低于同期的 UHMWPE 颗粒组。充分说明氧化锆颗粒不易引起细胞的炎症反应,从而减少骨溶解的发生。 总之，UHMWPE 颗粒较氧化锆颗粒激活巨噬细胞、异物巨细胞、成纤维细胞等的反应更快、更强烈，并由此引起一系列生物化学反应，最终导致更强的假体周围骨溶解和关节松动。然而由于假体周围骨溶解是一个多因素相互作用、相互调节的复杂过程,单一因素的实验结果能否说明氧化锆作为人工关节假体材料优于 UHMWPE,还有待于进一步研究。 【参考文献】 1 Hatton A, Nevel

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