大鼠岛叶与杏仁核电点燃癫痫模型的相关性研究.doc

1、大鼠岛叶与杏仁核电点燃癫痫模型的相关性研究作者：刘庆祝，王峰，牟青春，张培松，徐文中【摘要】 目的 电刺激 Sprague-Dawley大鼠岛叶、杏仁核及同时刺激岛叶、杏仁核建立复杂部分性癫痫模型，探讨岛叶癫痫的可能发病机制。方法 健康雄性 SD大鼠 60只，随机分成三组：岛叶点燃组(IK)、杏仁核点燃组(AK)、岛叶杏仁核同时点燃组(BK)。分别将双极电极植入左侧岛叶、左侧杏仁核和同时植入岛叶杏仁核；测定后放阈后每日给予两次电刺激，刺激参数：强度为后放阈 1.5倍，频率 60 Hz，波宽 1 ms，持续时间 1 s。结果 岛叶组和杏仁核组后放阈值差异有统计学意义(P0.05)；三组点燃时间差

2、异有统计学意义，岛叶组点燃最快，岛叶杏仁核同时点燃组点燃最慢(P0.05)；三组点燃率无明显差异。结论 岛叶是一个癫痫症状发作区；岛叶癫痫的发生、发展与杏仁核点燃存在差异；同时点燃表现为点燃的拮抗作用。 【关键词】 岛叶；杏仁核；点燃；癫痫模型Abstract: Objective To stimulate SpragueDawley Rat Insular, Amygdale or to stimulate insular and amygdale simultaneously and to establish Complicated Partial Epilepsy Model for i

3、nvestigating possible nosogenesis of Insular Epilepsy. Methods 60 male SpragueDawley Rats were divided into 3 groups randomly: Insular kindling group (IK), Amygdale kindling group (IK), Insular and amygdale simultaneously kindling group (BK). Bipolar electrodes were implanted into left Insular or le

4、ft Amygdale or both and rats were stimulated at 1.5 times of afterdischarge threshold twice daily. Stimulus train consisted of 1ms (square biphasic) pulses at 60 Hz, with train duration of 1s. Results There was significant difference in the aftercharge threshold between insular and amygdale kindling

5、 groups (P0.05). There was significant deviation at kindling speed among three groups: IK was the most rapid kindling group and BK group was kindled more slowly (P0.05). There was no significant difference in kindling rate among three groups. Conclusion Insular is an area that causes epilepsy sympto

6、m. The genesis and development of Insular Epilepsy are different from Amygdale Epilepsy and it shows antagonism to kindling.Key words: insular; amygdale; kindling; epilepsy model癫痫是常见的脑部发作性疾病，而岛叶癫痫由于位置深在、诊断困难、机制不清等原因成为最难处理的一类癫痫。岛叶在癫痫(特别是颞叶癫痫)中的作用，在国际上已逐渐被一些学者重视1 。而在国内,除少量有关岛叶占位性病变引起癫痫发作的病例报道外,此方面的研究

7、报道很少。电点燃模型是研究颞叶癫痫最理想的模型，它通过反复刺激特定脑区导致其癫痫发作活性不断增强， 最终形成稳定的癫痫发作状态2 。本研究试图通过电刺激 Sprague-Dawley大鼠岛叶、杏仁核及同时刺激岛叶杏仁核建立复杂部分性癫痫动物模型，观察三者在后放阈、点燃时间和触发阈值上的差异，并分析出现此种差异的可能原因，探讨岛叶在癫痫中的发病机制。1 材料和方法1. 1 实验动物及分组 68 周龄雄性 Sprague-Dawley大鼠 60只（宁夏医科大学实验动物中心提供） ，体重 250300g，单笼饲养，随机分为岛叶组(IK)、杏仁核组(AK)和岛叶杏仁核同时点燃组(BK)，每组 20只。

8、1.2 实验仪器 Alpha-Lab 多通道生理记录仪(ALAB000153， Israel)；脑立体定位仪(SR-5R， Japan)；生物电子刺激器(AM2100，USA)；ZH-RXZ 柔性颅骨钻(DIAMOND JEWELRY MADE BY ELECTRIC CO U.S.A) ；漆包镍铬电极(上海鼎阜金属材料有限公司)； 冷光四孔手术无影灯(广东汕头医疗器械厂)；CH2510型三孔接插件(宁波仪器厂)。1.3 动物模型的制备与实验 0.5%戊巴比妥钠(65mg/kg)麻醉大鼠，固定大鼠头部于脑立体定向仪，75%酒精局部消毒皮肤，正中切口约 1 cm，剪除部分皮肤、皮下组织和骨膜，暴

9、露颅骨及前后囟，创面止血。枕顶骨区、额骨区安放 45 个加固螺钉，枕骨区加固螺钉兼做接地电极。 立体定位3-4：岛叶（前囟前 1.2mm；旁开 5.5mm；硬膜下 5.5mm） ；杏仁核（前囟后 2.8mm；旁开 4.9mm；硬膜下 8.6mm）右额（前囟前 1.5mm;旁开 1.5mm；硬膜下0.5mm） ；左侧小脑（前囟后 12mm;旁开 3.0mm；硬膜下 4.0mm） 。双极电极安放于岛叶和杏仁核，作为刺激电极；单级电极安放于右额和左侧小脑，分别作为皮层记录电极和参考电极。所有电极均由三孔接插件引出,并用牙科水泥将接插件固定在颅骨表面。术后观察大鼠呼吸、心率、体温、血压和肤色，0.5h

10、 后各项指标均属正常，将鼠放回饲养笼，保证各鼠的单笼饲养；术后连续 3 d腹腔注射青霉素钠 5万 U/d；2 周后开始点燃实验，先测大鼠岛叶和杏仁核的后放电阈值，用 A-M SYSTEMS 2100刺激器给大鼠持续电流刺激，脉冲为双向方波，波宽 10 ms，频率 60 Hz，持续 1 s。岛叶刺激强度开始为100A，以后每隔 90 s增加 20A，杏仁核刺激强度开始为 40A，以后每隔 90 s增加 10A，直到 EEG记录到3s 的后发放电，为该大鼠的ADT。岛叶杏仁核组分别测得岛叶和杏仁核的 ADT。从测定 ADT的第一天起, 每天按 ADT 1.5倍强度刺激 2次，刺激间隔大于 1h，直

11、至出现 5次级发作，视为点燃成功。发作强度按Racine分级评分5：级：不动、闭眼，面肌轻微痉挛；级：点头；级：单侧前肢阵挛；级：双前肢阵挛；级：全身阵挛发作。且定时进行行为学以及自由活动状态下脑电图监测。实验结束时，各组大鼠戊巴比妥过量麻醉，经左心灌注取脑，4多聚甲醛后固定，蔗糖脱水，液氮中 OCT包埋后保存于-80冰箱中。美国 LEICA恒低温切片机行全脑冠状冰冻切片，片厚 14m，鉴定电极位置。1.4 统计学方法 分别比较岛叶和杏仁核点燃组及同时点燃组在 ADT、点燃速度、发作强度和触发阈值的差异。两个样本均数之间的比较采用 t检验，P0.05 为有统计学意义，统计软件采用 SPSS 1

12、1.5。2 结果2.1 本实验中记录的大鼠脑电图 见图 1-3。2.2 点燃特征 全部测量来源于自由活动大鼠。除去组织学证实未植入岛叶或杏仁核的大鼠。岛叶与杏仁核的 ADT、大发作触发阈值、点燃时间差异有统计学意义(P0.05)；岛叶组和杏仁核组大发作持续时间差异无统计学意义；岛叶杏仁核同时点燃组与岛叶组、杏仁核组点燃时间有统计学意义(P0.05)。表 1 三组大鼠后放阈值、点燃时间、癫痫大发作触发阈值及癫痫大发作持续时间比较(略)3 讨论在各种癫痫的动物模型中，点燃模型是目前应用最广泛的动物模型，目前已用于癫痫各方面的研究2 。电点燃是以同等强度的阈下刺激在一定的时间间隔下重复刺激动物边缘脑

13、区的某一部位，导致癫痫活动强度逐渐增加，最终出现全身性癫痫发作。动物点燃形成后具有如下特征：即使不再给予刺激，异常的 EEG规律性放电可维持一年以上，且再次电刺激引起阵挛性发作；少数动物可自发性发作；放电通过突触间隙传递；其癫痫发作行为类似于人类的复杂部分性发作伴继发性全身痉挛性发作；发作时 EEG异常类似于人类的复杂部分性发作间期杏仁核和海马结构电极描记的结果5 。岛叶是人脑的第五叶，外科医生常发现在颞叶切除术后，皮层脑电图所显示的切除后残留棘波常起源于岛叶，这提示岛叶具有致痫潜能，由于难以区别癫痫发作是起源于颞叶内侧后迅速扩展至岛叶，还是起源于岛叶然后扩散至颞叶的，所以常难以证实其为一独立

14、痫灶6 。在 20世纪 40年代末 50年代初， Guillaume7提出岛叶癫痫的概念，但是由于以上原因，一直没有证实岛叶是一个独立的癫痫发作区。最近一些学者认为，正如许多其他的部分性癫痫发作类型一样，当岛叶皮质被作为一个部分被涉及或作为一个单纯的癫痫起源，而不单单是一个癫痫传播的中转结构时，癫痫体系的概念可以描述为岛叶癫痫8 。在这个癫痫体系中，可能有三种传播方式9-10：即颞-外侧裂-岛叶体系，主要包括环绕岛叶的额、顶和颞部岛盖；颞-边缘-岛叶体系，主要包括颞叶内侧结构和(或)颞极；内侧-眶额-岛叶体系，主要包括岛叶内侧、眶额。但岛叶在这三种方式中具体起什么作用；在大脑皮质、颞边缘系统、

15、岛叶间癫性放电是如何传播的等诸多问题都未见相关文献报道。本次实验成功建立岛叶电点燃癫痫模型，并成功记录到自由活动大鼠安静状态下和癫痫发作时岛叶、杏仁核和皮层的脑电变化。癫痫发作时，岛叶、杏仁核和皮层都记录到癫痫波。在 IK组,共有 18只大鼠获得完全点燃，一只电极脱落，一只未点燃，平均刺激(7.522.31)d,点燃成功率为 90%。在 AK组，共有 17只大鼠获得完全点燃，2 只电极脱落，一只未点燃，平均刺激（11.263.68）d，点燃成功率为 85%。IK 和 AK组相比，对于诱发癫痫发作最敏感的参数 AD而言，IK 组显著高于 AK组，差异具有统计学意义(P0.05)，但点燃速度 IK

16、组与 AK组相比显著增快(P0.05)，这说明了在点燃的敏感程度上，岛叶与杏仁核相比欠敏感，但在癫痫发生、发展过程中，岛叶又比杏仁核明显增强，这也进一步证实了岛叶癫痫并不是仅仅以岛叶-杏仁核-海马复合体而发生的。岛叶癫痫可能通过颞-外侧裂-岛叶体系、颞-边缘-岛叶体系和内侧-眶额-岛叶体系的某一种体系或几种体系同时进行传播，这也可以解释为什么岛叶癫痫在发生、发展过程中较杏仁核点燃相对较快的原因。基于此，我们进一步证实了岛叶是一些癫痫发作的独立致癫源，而不仅仅是颞叶癫痫传播通路中的一个组成部分。其发作机制可能由于岛叶癫痫灶部位的不同，通过以上三种不同的方式传播。因岛叶的广泛的纤维联系，也可能其他

17、部位的癫痫灶波及岛叶，岛叶只是癫痫环路中的一部分。本次实验 BK组,所有的大鼠均发展为 5级癫痫发作,点燃成功率为100%，平均刺激（17.715.24）d，最长 20d,最短 15d，与 IK和 AK组大鼠达到 5级癫痫发作的刺激天数相比，BK 组痫性发作出现的速度显著减慢(P0.05)。其可能原因为 BK方法不仅促进了点燃的发生发展，而且也促进了点燃的拮抗作用11-12 。点燃的拮抗作用是一种正常点燃过程的终止。基于以上观点我们可认为 BK方法反映了兴奋性和抑制性机制的增强。前者与点燃的泛化和自发性痫性放电的发生直接相关；而后者与某种类型的点燃拮抗作用有关，从而导致点燃的减弱。岛叶杏仁核的

18、相互拮抗作用也进一步证实，如解剖学研究显示，岛叶和杏仁核之间存在纤维联系，岛叶纤维还投射到海马前部，在点燃的发生、发展过程中，岛叶杏仁核之间存在着电活动，但岛叶癫痫并不是仅仅通体海马杏仁核而发生的。本实验通过电刺激岛叶建立了慢性癫痫点燃模型，我们进一步证实了岛叶是一些癫痫发作的独立致痫源，本身即具备致痫潜能，而不仅仅是颞叶癫痫传播通路中的一个组成部分。岛叶属于旁边缘系统，与环绕岛叶的额、顶和颞部岛盖，颞叶内侧结构和(或)颞极，岛叶内侧、眶额等颞边缘系统有着复杂的纤维联系，癫痫是朝着与致癫区有着解剖生理联系的其他脑区传播，而形成一个癫痫性神经网络。但由于岛叶位置深在、纤维联系复杂等原因，岛叶癫痫

19、的致痫潜能、致痫机制，以及岛叶与边缘系统及旁边缘系统等结构在癫痫发生、发展过程中的相互关系还需要进一步研究证实。【参考文献】1Duffau H, Capelle L, Lopes M, et al. Medically intractable epilepsy from insular low-grade gliomas: improvement after an extended lesionectomy J. ActaNeurochir, 2002,144:563-572.2Stables JP, Bertram EH, White HS, et al. Models for epilep

20、sy and epileptogenesis: report from the NIH workshop, Bethesda, Maryland J. Epilepsia, 2002,43 (11):1410-1420.3L. LPEZ-VEL?ZQUEZ, E AGUIRRE，RG PAREDES. Kindling increases aversion to saccharin in taste aversion learning J. Neuro Science, 2007,144(7):808-814.4Hal Blumenfeld, Maritza Rivera, J. Gabrie

21、l Vasquez, et al.Neocortical and Thalamic Spread of Amygdala Kindled Seizures J.Epilepsia,2007,48(2):254-262.5Loscher W,Rundfeldt C,Honack D.Pharmacological characterizationof phenytoin-resisant amygdale- kindled ratsJ.Neurology,1998,51:41-48.6Schwartz TH.Insular seizures:have we been missing the bo

22、at? J.Epilepsy Curr,2005,5(4):147-148.7Guillaume MMJ, Mazars G, Mazars Y. Indications chirurgicales dans les pilepsies dites temporales J. Rev Neurol,1953,88:461-501.8Williamson D, Engel J, Munari C. Anatomic classification of localization-related epilepsy/ Engel J, Pedley T, eds. Epilepsy Lippincot

23、t-Raven,1997:2405-2426.9Aghakhani Y, Rosati A, Dubeau F, et al. Patients with temporoparietal ictal symptoms and inferomesial EEG do not benefit from anterior temporal resection J. Epilepsia,2004,45:230-236.10Ryvlin P, Minotti L, Demarquay G, et al. Nocturnal hypermotor seizures, suggesting frontal

24、lobe epilepsy, can originate in the insula J. Epilepsia, 2006,47(4):755-765.11Jun Lian, Marom Bikson, Christopher Sciortino, et al. Local Suppression of Epileptiform Activity by Electrical Stimulation in Rat Hippocampus In Vitro J. Physiol,2003,547(Pt 2): 427-434.12F. Le Jeune J， Pron I，Biseul, et al. Subthalamic nucleus stimulation affects orbitofrontal cortex in facial emotion recognitiona pet studyJ. Brain,2008, 131(6): 1599-1608.