大鼠脾脏P物质免疫反应神经纤维的分布及烫伤后含量变化.doc

1、大鼠脾脏 P 物质免疫反应神经纤维的分布及烫伤后含量变化【关键词】 烫伤 【Abstract】 AIM: To investigate the distribution and content change of substance P (SP) immunoreactive nerve fibers in the rat spleen post burn and to explore the relation between SP and immunological functions. METHODS: The distribution of SP immunoreactive nerve

2、 fibers was observed by the immunohistochemical ABC method combined with glucose oxidaseDABnikel enhancement technique. The rats were inflicted on the back with 20% TBSA of degree scalding by boiling water. The post burn changes in the tissue content of the SP in the spleen were determined by radioi

3、mmunoassay (RIA). RESULTS: The rat spleen was richly innervated by positive SP immunoreactive nerve fibers. The tissue content of SP in the spleen decreased significantly (P0.01) at 30, 60, 120 and 240 minutes post burn. CONCLUSION: The rat spleen is richly innervated by positive SP immunoreactive n

4、erve fibers and the content of SP in the spleen decreased significantly post burn. SP may play the role of enhancing immunological function. 【Keywords】 substance P; spleen; scalding; immunological function; rat 【摘要】 目的： 研究 P物质（substance P， SP）免疫反应阳性神经纤维在大鼠脾脏的分布及烫伤后含量变化，探讨 SP与免疫功能的关系. 方法 ： 用 ABC免疫组织化

5、学法结合葡萄糖氧化酶 DAB硫酸镍胺显色技术，观察 SP免疫反应阳性纤维在大鼠脾脏的分布；在大鼠背部造成占体表面积 20%的深度烫伤，烫伤后不同时间，采用放射免疫分析法测定大鼠脾内 SP含量的变化. 结果： 在大鼠脾脏内有较丰富的 SP免疫反应阳性神经纤维，多呈串珠状走行于淋巴组织中；与对照组比较，大鼠烫伤后脾脏 SP含量(ngg-1) 30 min, 13.74.3 vs 20.13.2, P0.05；60 min, 11.84.4 vs 18.27.5, P0.05；120 min, 7.62.2 vs 17.17.5, P0.01; 240 min, 8.12.6 vs 16.56.4,

6、 P0.01明显下降. 结论： 大鼠脾脏内含有较丰富的 SP免疫反应阳性神经纤维，烫伤后脾内 SP含量明显下降，提示 SP可能是导致烧伤后机体免疫功能抑制的因素之一. 【关键词】 P 物质；脾脏；烫伤；免疫功能；大鼠 0 引言 烧伤作为一种强烈的应激状态可引起神经内分泌系统的变化1. P物质（substance P, SP）作为神经肽中速激肽类主要成分之一，是一重要的神经内分泌介质. 胡大海等2报道，大鼠烫伤早期垂体前叶 SP神经纤维分布范围及数目密度有明显变化. 脾脏是机体重要的免疫器官，脾内是否含有 P物质，烧伤后其含量变化以及与机体免疫抑制的关系如何，我们分别应用 ABC免疫组织化学法结

7、合葡萄糖氧化酶 DAB硫酸镍胺显色技术和放射免疫分析法，观察了 SP免疫反应阳性纤维在大鼠脾脏的分布以及烫伤后大鼠脾内 SP含量变化，并对 SP与免疫功能的关系进行了探讨. 1 材料和方法 1.1 材料正常成年雄性 SD大鼠 90只（第四军医大学实验动物中心提供） ，体质量 200 220 g. 取 10只用于免疫组织化学形态学研究. 余80只，随机分为 8组（n=10)：烫伤大鼠分为 30, 60, 120和 240 min 4组，对照大鼠对应为 30, 60, 120和 240 min 4组，分别在烫伤和假烫伤 30, 60, 120和 240 min断头处死. 1.2 方法 1.2.1

8、免疫组化染色实验大鼠在乙醚吸入麻醉下，经升主动脉插管灌流固定. 先以生理盐水快速冲洗，继之灌入 40 gL-1多聚甲醛约 400 mL, 取出脾脏，置于同一固定液中后固定 6 h，随后浸泡于含 200 gL-1蔗糖的 0.1 molL-1 PB液中，4过夜. 制备 30 m 厚的恒冷箱切片，行漂浮法 ABC结合葡萄糖氧化酶 DAB硫酸镍胺显色技术免疫组织化学染色. 染色程序：切片先经 3 mLL-1甲醇双氧水封闭 30 min后入10 gL-1 Triton X100孵育 30 min. 然后转入兔抗 SP抗体（13000， INC公司） ，4孵育 24 h，再依次进入生物素标记的猪抗兔 Ig

9、G抗血清（1500，Dako 公司）室温孵育 4 h，卵白素生物素复合物（ABC，1200，Dako 公司）中室温孵育 2 h. 然后用葡萄糖氧化酶DAB硫酸镍胺显色液显色 20 min. 以上各步骤之间均用 10 mmolL-1磷酸缓冲盐水（PBS, pH 7.4）漂洗 3次，每次 10 min. 显色结束后，标本经 PBS充分漂洗，30 gL-1中性红复染 3 min，继而干燥、脱水、透明、树胶封片. 标本用 Olympus BH2型显微镜观察并摄片. 以正常兔血清替代第一抗体，作为阴性对照. 1.2.2 烫伤动物模型的制备烫伤前 24 h用 0.8 gL-1的 Na2S背部脱毛，清醒状态

10、下，将大鼠脱毛区置于恒温水浴锅 100热水内持续 16 s，造成占体表面积 20%的深度烫伤. 烫伤深度病理证实. 按各组不同的时间间隔作断头处理. 对照组大鼠的处理同上，只是将100沸水换成 37水做假烫伤. 伤后立刻腹腔注射无菌等渗盐水（3 mL/100 g体质量）抗休克，单笼喂养. 创面不予处理. 1.2.3 脾脏标本的制备大鼠断头后，立即将脾脏取出，置沸生理盐水中煮 5 min，以灭活肽酶. 称质量后，移入含 0.1 molL-1乙酸1 mL的匀浆管中充分匀浆，在室温搁置 2 h再加入 0.1 mol L1 的氢氧化钠 1 mL. 离心（300 rmin-1, 10 min） ，取上清

11、液置入70冰箱保存待测. 1.2.4SP 含量的放射免疫测定按 SP免疫测定试剂盒（北京科荟生物工程应用技术研究所生产）的操作规程采用顺序饱和加样程序进行. 统计学处理：数据用 xs表示，采用 SPSS统计学软件进行方差分析. 2 结果 经 ABC免疫组织化学法结合葡萄糖氧化酶 DAB硫酸镍胺显色技术染色的大鼠脾脏切片标本内，见有较丰富的 SP免疫反应阳性神经纤维分布，呈深蓝色的串珠状或点线状，膨体明显，主要分布于红髓，以脾血窦和小血管周围多见，有的可达血管壁和血窦壁；SP 免疫反应阳性神经纤维也见于脾索和边缘区的淋巴组织内，穿行淋巴细胞之间，与淋巴细胞关系密切（Fig1 A, B）. 放射免

12、疫分析法测定大鼠脾内 SP含量在烫伤后30 min明显下降仅对照组值的 68% (P0.05) ；烫伤后 60 min和 120 min含量继续下降，分别为对照组值的 64% (P0.05) 和 44% (P0.01)；烫伤后 240 min时 SP含量略有回升，但仍显著低于对照组，为对照组值的 49% ( P0.01, Tab 1 ). A: fibers around the branches of the arteries200; B: fibers along the splenic cord and the splenic sinusoid400. 图 1脾脏组织 SP免疫反应阳性神

13、经纤维（略） Fig 1SP immunoreactive nerve fibers in the spleen（略） 表 1烫伤大鼠脾内 SP含量的变化（略） Tab 1Change of SP content in spleen of rat after burn（略） 3 讨论 SP 由 11个氨基酸组成，属速激肽家族，为最早发现的神经肽之一，由于其体内分布广泛且与很多重要的生理病理变化密切相关，因而在许多领域受到关注及研究. 脾脏是机体重要的免疫器官，我们用 ABC免疫组织化学法结合葡萄糖氧化酶 DAB硫酸镍胺显色技术和放射免疫测定方法，证实大鼠脾脏有 SP免疫活性物质存在. 脾脏淋巴

14、组织中可见 SP免疫反应阳性神经纤维，穿行淋巴细胞之间，与淋巴细胞关系密切. 已有人证实免疫细胞存在 SP受体 3, 4 ，由此我们推测，穿行于淋巴组织实质内的 SP免疫反应阳性神经纤维，很可能是通过其末梢释放 SP免疫活性物质，作用于脾内免疫细胞上的 SP受体，进而影响免疫功能，这还有待于进一步的研究证实. 烧伤可引起机体免疫功能抑制，尤其是细胞免疫功能抑制更为明显5 ，而持续的细胞免疫功能抑制往往导致致死性败血症. 但造成烧伤后免疫抑制的原因及始动环节，目前仍不十分清楚. 因此，研究烧伤后免疫抑制的机制显得十分必要. 本实验的结果显示，大鼠烧伤后脾内 SP含量明显下降，提示可能是导致烧伤后

15、机体免疫功能抑制的因素之一，亦即 SP可能有增强机体免疫功能的作用. 这种对免疫功能增强的作用可能表现在多方面：如上述的 SP可能通过其受体直接作用于免疫细胞，也可能通过刺激细胞因子、炎性介质或其他信号分子的释放，间接地对免疫功能产生影响6. 已有实验证实 SP既能促进单核巨嗜细胞的趋化、游走活性和吞噬功能；刺激单核巨嗜细胞氧化爆发反应及释放多种免疫活性因子；促进 B淋巴细胞合成免疫球蛋白，亦可增强刀豆素 A及植物血凝素所致的人外周血 T淋巴细胞的增殖反应，刺激嗜中性粒细胞的趋化运动7-9. 这些结果从另一个角度表明了，SP 有增强免疫功能的作用. Onuoha 等10亦认为，SP 作为一种神

16、经调质，在烧伤后机体免疫、疼痛、炎症以及创伤恢复中起着重要作用. 至于在烧伤条件下脾内 SP含量减低是神经肽的合成下降，还是降解加速所致，尚需进一步研究证明. 本实验结果为阐明神经系统对免疫系统的作用和途径，为进一步探讨烧伤后机体免疫抑制的机制提供了资料. 【参考文献】 1 Prete P, Levin ER, Pedram A. The in vitro effects of endogenous opiates on natural killer cells,antigenspecific cytolytic T cells, and Tcell subsets J. Exp Neurol

17、, 1986; 92(2):349-359. 2 Hu DH, Chen B, Wang BL, Ma D. Changs of substance Plike immunoreactive nerve fibers in the anterior pituitaries of rats after scald J. Med J Ndfnc, 2001;22 (1):6. 3 Stanisz AM, Scicchitano R, Dazin P, Bienenstock J, Payan DG. Distribution of substance P receptors on murine s

18、pleen and Peyers patch T and B cells J. J Immunol, 1987;139(3):749-754. 4 Goode T, OConnell J, Ho WZ, OSullivan GC, Collins JK, Douglas SD, Shanahan F. Differential expression of neurokinin1 receptor by human mucosal and peripheral lymphoid cells J. Clin Diagn Lab Immunol, 2000;7(3):371-376. 5 Schwa

19、cha MG, Chaudry IH. The cellular basis of postburn immunosuppression: Macrophages and mediators J. Int J Mol Med, 2002;10(3):239-243. 6 Dunnick CA, Gibran NS, Heimbach DM. Substance P has a role in neurogenic mediation of human burn wound healing J. J Burn Care Rehabil, 1996;17 (5 ):390-396. 7 Luger

20、 TA, Brzoska T, Scholzen TE, Kalden DH, Sunderkotter C, Armstrong C, Ansel J. The role of alphaMSH as a modulator of cutaneous inflammation J. Ann N Y Acad Sci, 2000;917:232-238. 8 Ho WZ, Stavropoulos G, Lai JP, Hu BF, Magafa V, Anagnostides S, Douglas SD. Substance P Cterminal octapeptide analogues

21、 augment tumor necrosis factoralpha release by human blood monocytes and macrophages J. J Neuroimmunol, 1998;82 (2 ):126-132. 9 Ho WZ, Kaufman D, Uvaydova M, Douglas SD. Substance P augments interleukin10 and tumor necrosis factoralpha release by human cord blood monocytes and macrophages J. J Neuroimmunol, 1996;71(12):73-80. 10 Onuoha GN, Alpar EK. Levels of vasodilators (SP, CGRP) and vasoconstrictor (NPY) peptides in early human burns J. Eur J Clin Invest, 2001;31(3):253-257.