大鼠胸主动脉球囊损伤后早期平滑肌细胞凋亡观察.doc

1、大鼠胸主动脉球囊损伤后早期平滑肌细胞凋亡观察【摘要】 目的 探讨大鼠胸主动脉球囊损伤后早期细胞凋亡和凋亡相关基因表达的变化及其规律。方法 将 36 只雄性 SD 大鼠随机分为两组，手术组(n=30)行球囊扩张损伤大鼠胸主动脉术；对照组(n=6)不行球囊损伤。取正常及损伤术后即刻、30 min、1 h、2 h、4 h 胸主动脉，应用苏木精 伊红染色、TUNEL 法、免疫组化和计算机图像分析等方法进行形态学观察，进行细胞凋亡、凋亡基因 Fas、抗凋亡基因 Bcl2 表达水平检测。结果 正常大鼠胸主动脉管腔面有单层完整内皮细胞，内外弹力层呈波浪形，完整连续；手术组球囊损伤后可见内弹力层模糊，多处断裂

2、，管腔面毛糙无内皮细胞；损伤后 4 h 中膜平滑肌细胞密度较对照组减少。对照组、手术组损伤后即刻胸主动脉偶见凋亡细胞；手术组球囊损伤后30 min，管壁中膜可见大量凋亡平滑肌细胞，损伤后 1、2 h 中膜凋亡细胞明显减少，损伤后 4 h 中膜仅偶见凋亡细胞。对照组、手术组动脉损伤后即刻胸主动脉偶见 Fas 阳性平滑肌细胞，球囊损伤后 30 min 中膜可见大量 Fas 阳性细胞，损伤后 1、2 h 中膜 Fas 阳性细胞明显减少，动脉损伤后 4 h 仅偶见 Fas 阳性平滑肌细胞。对照组动脉壁显著表达Bcl2 ，手术组胸主动脉中膜 Bcl2 表达迅速下降，损伤后 1 h 达最低水平，后回升。B

3、cl2 与 Fas 表达呈负相关(r=-0.816，P0.01)。结论 平滑肌细胞凋亡可能在动脉损伤后平滑肌细胞过度增殖和迁移过程中具有重要作用。 【关键词】 肌细胞 平滑肌 血管 凋亡 Fas Bcl2 球囊损伤 大鼠 ABSTRACTObjectiveTo investigate the early changes of apoptosis and the expression of Fas/Bcl2 in rat aorta after balloon withdrawal injury.MethodsThirtysix SD rats were randomly divided int

4、o two groups: operation group (n=30) and control group (n=6). The rats in operation group had balloon induced endothelium denudation in thoracic aorta and were killed at the time of balloon injury and 0.5, 1, 2, and 4 hours later. Using TUNEL labeling, immunohistochemistry, and computerized image an

5、alysis to observe the aorta for smooth muscle cell apoptosis, the expression of Fas/Bcl2 and the morphology.ResultsThe surface of vessel lumen of normal rat aorta had a monolayer of integrated endothelial cells. The internal elastic lamina was ruptured after the injury, and no endothelial cells were

6、 found. The density of vascular smooth muscle cells was reduced obviously 4 hours later. Few apoptotic cells were detected in the uninjured control vessels and in vessels immediately after injury. Remarkable medial vascular smooth muscle cells appeared apoptotic at 30 min, and then significantly red

7、uced at 1 or 2 hours, and were occasionally seen 4 hours later. In normal rat arteries, Bcl2 was detected after balloon injury, its expression in media reached the lowest level at 1 hour and then upregulated. The expression of Fas and Bcl2 showed remarkably negative correlation (r=-0.816,P0.01).Conc

8、lusionThe changes of apoptosis of smooth muscle cells probably play an important role in the process of excessive proliferation and transfer of the muscle cells after artery injury. KEY WORDSmyocyte, smooth muscle; blood vessels; apoptosis; Fas; Bcl2; balloon injury 目前支架介入治疗已成为冠心病治疗中积极有效的办法，其在挽救急性冠状

9、动脉综合征病人生命及改善冠心病病人长期生活质量方面的作用已得到充分肯定。但术后再狭窄（RS）大大影响了经皮腔内冠状动脉成形术（PTCA）及支架置入术后远期疗效。研究表明，PTCA 后血管平滑肌细胞（VSMC）的过度增殖和迁移在新生内膜过度增生、血管重塑和再狭窄的病理过程中起关键作用。人们围绕平滑肌细胞增殖做了大量基础及临床研究，但再狭窄仍然是困扰心血管介入医生的一大难题1。血管平滑肌的凋亡在许多心血管疾病中具有重要意义2，但动脉损伤后细胞凋亡的变化规律及其在再狭窄过程中的意义有待进一步阐明。本实验旨在研究大鼠胸主动脉球囊损伤后早期细胞凋亡规律，为再狭窄的防治提供可能的途径和理论依据。 1 资料

10、与方法 1.1 动物分组及处理 选用体质量 400500 g 的雄性 SD 大鼠 36 只(购于北京医科大学动物中心)，随机分为两组。对照组(n=6)不行球囊损伤，作为正常对照。手术组(n=30)行球囊损伤胸主动脉术，按术后处死时间又分为术后即刻、30 min、1 h、2 h、4 h 等不同亚组，每组 6 只。 1.2 大鼠胸主动脉球囊损伤模型及标本制作 手术组参照文献3建立方法用戊巴比妥钠（30 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，经左侧颈总动脉插入 2F 球囊导管，仔细操作导管越过主动脉弓进入胸腹主动脉远端（即肾动脉分叉处） ，注入生理盐水 0.150.20 mL回拉至主动脉弓颈总动脉开口处，重

11、复 6 次并旋转方向以充分剥脱内皮, 损伤胸主动脉，之后取出导管，缝合切口。为证实手术成功，参照文献3，取 3 只大鼠，术后即刻从大鼠左颈静脉注入 5 g/L Evan 蓝（3 mL/kg） ，1 h 后处死动物，观察内皮剥脱情况，并制作术后即刻主动脉苏木精 伊红染色切片，证明主动脉内皮剥脱完全，管壁弹力层可见部分断裂。分别在术后即刻、30 min、1 h、2 h、4 h，麻醉大鼠后开胸暴露主动脉，取横膈上 12 cm 处血管段，投入 40 g/L 中性缓冲甲醛溶液中固定 24 h，然后脱水，透明，石蜡包埋,切片（4 m） 。 1.3 形态学观察 组织切片经苏木精 伊红染色,光学显微镜下观察正

12、常及球囊损伤后主动脉管壁形态学改变，并用 VIDAS 图像分析仪（德国）计数中膜平滑肌细胞数目，计算单位面积平滑肌细胞密度。 1.4 凋亡细胞测定 应用 TUNEL 凋亡试剂盒（北京中山生物技术公司）检测，按试剂盒说明书操作，细胞中出现棕黄色染色者为凋亡阳性细胞，VIDAS 图像分析仪（德国）测定阳性细胞数，计算细胞凋亡率。 1.5 凋亡基因表达的检测 应用免疫组化 SP 法测定正常及球囊损伤后主动脉管壁中凋亡基因Fas 和抗凋亡基因 Bcl2 的表达，SP 试剂盒购于北京中山生物技术公司，按试剂盒说明书操作。Fas 阳性表达定位于细胞胞膜和胞浆，呈黄至棕黄色，Bcl2 阳性表达定位于胞浆。用

13、 VIDAS 图像分析仪（德国）随机测量每张切片 6 个视野中阳性细胞的百分率、平均吸光度（A）值，取其均数，用两者乘积再乘以 100 作为阳性表达指数表示 Fas、Bcl2 的表达水平。 1.6 统计学分析 用 SPSS 11.0 软件进行相关的统计学处理，结果用s 表示，数据间比较采用 t 检验，相关分析采用直线相关分析。 2 结 果 2.1 胸主动脉损伤后血管形态学变化 对照组管壁腔面有单层完整内皮细胞，内外弹力层呈波浪形，完整连续。手术组术后即刻可见内弹力层模糊,多处断裂，管腔面毛糙无内皮细胞；术后 30 min、1 h、2 h 无新生内皮细胞，中膜无增殖现象；术后4 h 仍无新生内皮

14、细胞，中膜平滑肌细胞密度为（20221）/mm2，对照组为（24026）/mm2，差异有显著性(t=3.533，P0.05)。 2.2 胸主动脉损伤后管壁平滑肌细胞凋亡情况 对照组管壁平滑肌细胞偶见凋亡细胞, 细胞凋亡率为（1.50.4）%；手术组术后 30 min 管壁中膜可见大量凋亡平滑肌细胞，多集中于管腔面，细胞凋亡率为（68.36.2）%；术后 1、2 h 中膜凋亡细胞明显减少，细胞凋亡率分别为（50.57.1）%、 （7.72.9）%；术后即刻及术后 4 h 中膜仅偶见凋亡细胞，细胞凋亡率分别为(1.70.5)%、(1.70.3)%。术后即刻、30 min、1 h、2 h、4 h 细

15、胞凋亡率间比较，差异有显著性（t=3.54212.378,P0.05） ；对照组及手术组术后即刻、术后 4 h 细胞凋亡率间比较，差异无显著性（t=2.274,P0.05） 。2.3 胸主动脉损伤后凋亡基因 Fas 的表达 术后 30 min、1 h、2 h 中膜平滑肌细胞 Fas 阳性表达指数分别为18.233.78、11.382.86、3.361.08，而对照组、手术组术后即刻、4 h 偶见 Fas 阳性细胞，阳性表达指数分别为0.730.25、0.690.18、0.830.21。术后即刻、30 min、1 h、2 h、4 h 阳性表达指数间比较，差异有显著性（t=3.58611.975,

16、P0.05） ；对照组、术后即刻、术后 4 h 细胞凋亡率比较，差异无显著性（t=1.976,P0.05） 。 2.4 胸主动脉损伤后抗凋亡基因 Bcl2 表达变化 正常动脉中膜 Bcl2 显著表达，Bcl2 阳性表达指数为28.234.67；动脉损伤后抗凋亡基因 Bcl2 表达下调，术后即刻、30 min 阳性表达指数分别为 25.203.76、12.263.05；术后 1 h 达最低水平，阳性表达指数为 4.261.28；术后 2、4 h 表达回升，阳性表达指数分别为 10.272.75、16.353.25。术后即刻、30 min、1 h、2 h、4 h Bcl2 阳性表达指数间比较，差异

17、均有显著性（t=3.23812.021，P0.05） ；对照组、手术组术后即刻 Bcl2 阳性表达指数间差异无显著意义（t=2.221，P0.05） ；Bcl2 表达与凋亡基因 Fas 表达呈负相关(r=-0.816，P0.01)。 3 讨 论 冠心病介入治疗后再狭窄已证实是在原有冠状动脉粥样硬化病变基础上，机械扩张损伤后的过度损伤反应3。动脉损伤后的凋亡贯穿于损伤反应的全过程，阐明凋亡规律并进行适当干预对于再狭窄的防治可能具有重要意义。 VSMC 凋亡是细胞程序性死亡过程，受许多凋亡基因、抗凋亡基因和细胞因子影响，如 Fas、Bax、Bcl2 、cmyc 、TNF 等，各种化学因子、细胞因子

18、、机械刺激都可通过影响凋亡调节基因的表达，从而影响细胞的生存和凋亡。凋亡的主要途径是 Caspase 途径，而 Caspase 途径的上游启动程序为 Fas 与其配体 FasL 的结合，因此 Fas 被认为是重要的凋亡基因，其表达水平与凋亡程度呈正比。细胞存活力主要由基因家族介导凋亡和抗凋亡信号之间的平衡来控制，其中最主要的是 Bcl2 家族，通过抑制细胞凋亡来延长细胞的存活时间，被认为是凋亡抑制基因4。 近年研究发现，在人类的心血管系统中亦存在细胞凋亡的现象，且与许多心血管疾病的发生、发展密切相关。脉管系统细胞凋亡由Fas/FasL 信号介导。血管细胞凋亡是血管重构的一个主要特点，对急慢性血

19、管损伤后的血管重构起重要的作用，尤其是对血管机械性损伤后的再狭窄有重要的影响5。腺病毒编码 FasL 在球囊损伤的大鼠颈动脉局部释放，诱导增生的平滑肌细胞产生凋亡并且有效抑制了新生内膜的增厚6。正常血管内皮细胞可以抑制 Fas 介导的凋亡7。Bcl2 蛋白家族在 VSMC 中具有重要作用，在血管狭窄处通过反义 RNA 技术去除BclXL 可以诱导 VSMC 的凋亡，从而减轻新生内膜增厚8。 正常血管中膜平滑肌细胞保持合适的密度，血管形态结构保持相对稳定。已有研究结果显示，在大鼠颈动脉和兔髂动脉球囊损伤后 24 h，中膜平滑肌细胞数目减少 25%，中膜 DNA 含量下降 35%40%9，这与本研

20、究中动脉损伤后早期细胞凋亡一致；但是随之而来的是显著的细胞分裂、增殖和迁移，导致新生内膜过度增生、管壁负性重塑、管腔狭窄，相关研究同时发现平滑肌细胞表型变化及 P21、P27 表达在此过程中具有重要意义10,11。 本实验结果揭示了动脉损伤后早期 VSMC 凋亡出现规律性改变，可能在动脉损伤后 VSMC 过度增殖和迁移过程中具有重要作用。外界物理、化学及机械因素诱导细胞凋亡导致的细胞密度下降，可能在启动剩余细胞过度增殖和迁移中扮演重要角色，这为再狭窄的防治提供了可能的研究方向和理论依据，但更深入的分子机制及临床意义尚待进一步研究。 【参考文献】 1GRUBE E, GERCKENS U, BU

21、ELLESFELD L. Drugeluting stents: clinical experiences and perspectivesJ. Minerva Cardioangio, 2002,50(5):469473. 2WALSH K, ISNER J M. Apoptosis in inflammatoryfibroproliferative disorders of the vessel wallJ. Cardiovasc Res, 2000,45:756765. 3LEE C W, PARK S J, PARK S W, et al. Alltransretinoic acid

22、attenuates neointima formation with acceleration of reendothelialization in ballooninjured rat aortaJ. J Korean Med Sci, 2000,15(1):3136. 4KOCKX M M, HERMAN A G. Apoptosis in atherosclerosis: benificial or dertrimentalJ. Cardiovasc Research, 2000,45:736746. 5KIM H S, HWANG K K, SEO J W, et al. Apopt

23、osis and regulation of Bax and BclX proteins during human neonatal vascular remodelingJ. Arterioscler Thomb Vasc Biol, 2000,20:957963. 6GENG Y J, HENDERSON L E, LEVESQUE E B, et al. Fas is expressed in human atheroslerotic intima and promotes apoptosis of cytokineprimed human vascular smooth muscle

24、cellsJ. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 1997,17:22002208. 7SATA M, SUHARA T, WALSH K. Vascular endothelial cells and smooth muscle cells differ in their expression of Fas and Fas ligand and in their sensitivity to Fas ligandinduced cell death: implications for vascular disease and therapyJ. Arteriosc

25、ler Thromb Vasc Biol, 2000,20:309316. 8POLLMAN M J, HALL Z L, MANN M J, et al. Inhibition of neointiml cell bclx expression induces apoptosis and regression of vascular diseaseJ. Nat Med, 1998,4:222227. 9BEOHAR N, FLAHERTY J D, DAVIDSON C J, et al. Antirestenotic effects of a locally delivered caspase inhibitor in a balloon injury modelJ. Circulation, 2004,109:108113. 10董果雄,褚现明,张社华,等. 全反式维甲酸对球囊剥脱大鼠胸主动脉内皮后平滑肌细胞增殖和 P21 表达的影响J. 中国分子心脏病学杂志, 2003,3(6):339343. 11褚现明,钟志欢,王国栋,等. 全反式维甲酸对球囊损伤大鼠胸主动脉 VSMC 表型变化及增殖的影响J. 青岛大学医学院学报, 2005,41(4):297301.