灯盏花素注射液中非法添加物的研究初探.doc

1、灯盏花素注射液中非法添加物的研究初探作者：葛建华，刘丽芳，郑红利 朱磊，谢丽丽 【摘要】 目的：分析中成药灯盏花素注射液中的非法添加物。方法：通过理化鉴别、薄层色谱法、紫外分光光度法、高效液相色谱法等方法初步对添加物进行定性，采用 HPLC 方法对添加物的含量进行测定。结果：非法添加物呈维生素 C 鉴别的阳性反应；且维生素 C 进样量与峰面积在0.10041.0040 g 范围内，呈良好的线性关系，回归方程 Y=3006.7x-9.5449，r=0.9998（n=6） ；平均回收率为 102.05%（n=6） 。结论：灯盏花素注射液中非法添加维生素 C,并测得其含量为 8.0858 mg/ml

2、。 【关键词】 灯盏花素注射液；高效液相色谱法；薄层色谱法；紫外分光光度法；维生素 CAbstract Objective: To analyse the illegal additive in TCM breviscapine injection. Method: Methods of chemical reactions ,TLC,UV-Spectrophotometry and HPLC, were adopted for the qualitative analysis. Results: Chemical reactions which were applied to test Vc

3、 were positive .There was a good relationship when the content of VitC was 0.10041.004 (r=0.9998).The average recovery was 102.05%. Conclusion: The experimental results indicated that: VitC was added to the injection illegally ,and the content of VC was 8.0858mg/ml.Keywords TCM breviscapine injectio

4、n；High performance liquid chromatography；Ultraviolet spectrophotometry；Thin-layer chromatography；Vitamine C灯盏花素注射液被收载于中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂第 20 册，具有活血化瘀，通络止痛之功效1。灯盏花素是从菊科植物短葶飞蓬中提取的黄酮类成分，是以灯盏花乙素为主，含少量灯盏花甲素的混合物2，主要用于治疗心血管疾病，改善血液循环。笔者对黑龙江某厂生产的一批灯盏花素注射液进行光谱扫描时，发现本该在 284 nm1波长处出现的最大吸收漂移至 270 nm 处，经多方面分析研究

5、,怀疑擅自添加维生素 C 类物质。中成药的毒副作用较小，在中药中擅自添加西药成分对患者危害较大。本文通过多种分析方法，对该批注射液中的添加物进行了初步的鉴别测定。1 仪器与试药ZF-2 型三用紫外分析仪；SARTORIUS BP 211D 电子分析天平；瓦里安 Cary 100 紫外可见分光光度计；Agilent1100 系列高效液相色谱仪（四元梯度泵、二极管阵列检测器） ； METTLER 320pH 酸度计。对照品：维生素 C（中国药品生物制品检定所，批号：100425-200301） ；供试品：灯盏花素注射液（黑龙江某制药厂生产，批号：060204） ；阴性对照品：灯盏花素注射液（山西省

6、万荣三九药业有限公司生产，批号：0606271） ；薄层硅胶预制板：HF254， 200 mm200 mm（青岛海洋化工厂生产） ；HPLC 用甲醇为色谱纯，水为重蒸馏水；其它试剂均为分析纯。2 方法与结果21 定性研究211 理化鉴别3 （1）取供试品 5 ml，加硝酸银试液0.5 ml，即生成银的黑色沉淀；（2）取供试品 5 ml，加二氯靛酚钠试液12 滴，试液的颜色即消失。可见，供试品呈现维生素 C 鉴别的阳性反应。212 薄层色谱法鉴别 （1）溶液的制备：精确称取维生素 C 对照品 13.98 mg，置 5 ml 容量瓶中，加入乙醇适量使其溶解，用乙醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

7、精密量取供试品、阴性对照品各 1 ml 分别置 10 ml 容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，分别作为供试品、阴性对照品溶液；（2）试验方法及其结果：取对照品溶液、供试品溶液各 2 l，阴性对照品溶液 4 l，分别点于同一硅胶 HF254 薄层板上，以氯仿-乙醇-冰醋酸-水（5442109）为展开剂，暗处饱和 15分钟，展开，取出，晾干后在紫外光灯（254 nm）下检视。结果供试品溶液在与维生素 C 对照品溶液相应的位置上显相同颜色的荧光斑点（比移值 Rf 供试品= RfVc 对照品=0.53） ，而阴性对照品溶液在相应的位置处没有显示荧光斑点。213 紫外分光光度法鉴别 （1）溶液的制备：精确

8、量取上述对照品溶液 0.2 ml 置 50 ml 容量瓶中，加 0.01 mol/L HCl 溶液稀释至刻度,摇匀, 作为对照品溶液。精密量取供试品溶液、阴性对照品溶液各 1 ml 分别置 10 ml 容量瓶中，加 0.01 mol/L HCl 溶液稀释至刻度，过滤，分别吸取续滤液 1 ml 置 100 ml 容量瓶中，加 0.01 mol/L HCl 溶液稀释至刻度,摇匀,分别作为供试品、阴性对照品溶液；（2）方法及结果：取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液，分别于 200300 nm波长进行光谱扫描测定。结果对照品溶液、供试品溶液在 242 nm 波长处均有唯一最大吸收峰（此为维生素类

9、在酸性条件下的特征吸收峰） ，而阴性对照品溶液在该波长处无吸收峰（见图 1） 。214 高效液相色谱法鉴别 （1）色谱条件：色谱柱：C18柱（5 m，4.6 mm250 mm） ；流动相：甲醇-0.03 mol/L 磷酸二氢钾缓冲液（用磷酸调节 pH 值至 3.0） （595） ；检测波长 243 nm；流动相流速 0.9 ml/min；柱温 30；进样量 10 l；（2）溶液的制备：精密称取维生素 C 对照品 10.04 mg，置 100 ml 的容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀,用微孔滤膜(0.45 m)过滤,取续滤液, 作为对照品溶液。精密量取供试品溶液、阴性对照品溶液各 1 ml，分

10、别置 100 ml 的容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀后精密量取 5 ml，置 10 ml 容量瓶中，加流动相稀释至刻度，分别作为供试品、阴性对照品溶液；（3）试验方法及其结果：分别吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照品溶液注入高效液相色谱仪测定。结果对照品溶液、供试品溶液在相同的保留时间处有色谱峰，而阴性对照品溶液在此保留时间处无色谱峰，且对照品溶液和供试品溶液在此保留时间处的光谱图一致（见图 2，3，4） 。22 定量研究221 色谱条件，溶液的制备及试验方法同 2.1.4。222 标准曲线的制备 用移液管分别精密移取对照品溶液2.5，5，10，15，20，25 ml 置 25 ml 容

11、量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45 m）过滤,取续滤液,进样。以峰面积 Y 与对照品进样量 X 进行线性回归计算，结果表明对照品在 0.10041.004 g范围内，线性关系良好，其回归方程：Y=3006.7x-9.5449，r=0.9998。223 方法学考察及含量测定 （1）精密度实验：精密量取“2.1.4（2） ”项下的对照品溶液 10 ml 置 25 ml 容量瓶中，加入流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，连续进样 6 次，测定峰面积，计算 RSD 为0.86%；（2）重复性实验及含量测定：照“214（2） ”项下供试品溶液的制备方法，配制 6 份供试品溶液，分别进样，测

12、定峰面积，计算得本品含量为 8.0856 mg/ml, RSD 为 1.86%；（3）稳定性实验：精密量取“2.1.4（2） ”项下的对照品溶液 10 ml 置 25 ml 容量瓶中，加入流动相稀释至刻度，摇匀，滤过。每隔 30 分钟进样一次,测定峰面积，计算其RSD 为 0.83%。可见，对照品溶液在 3.5 h 内稳定；（4）加样回收试验：对照品溶液的制备：精密称取维生素 C 对照品 51.41 mg，置 100 ml 容量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，即得。精密量取已知含量的供试品溶液 6 份，每份 0.5 ml。1，2 两份精密加入上述对照品溶液 6 ml；3，4 两份 8 ml；5

13、，6 两份 10 ml，分别用流动相稀释，测定。回收率=（测得含量-样品含量）/加入量100%；（5）空白试验。取“214（2） ”项下的阴性对照品溶液，进样分析，可见灯盏花素注射液中其他成分对该波长处的测定无干扰（见图 4） 。3 讨 论本文通过不同鉴别方法进行相互验证，初步认为该批灯盏花素注射液中的非法添加物为维生素 C 类。要确定其结构，还需应用 MS、NR 等分析方法，作进一步研究。维生素 C 是无毒的营养素， 本案例中的维生素 C 很可能是作为抗氧剂加入的，但已影响到该制剂的质量检验结果，故视为非法添加。以甲醇-0.03 mol/L 磷酸二氢钾缓冲液(用磷酸调节 pH 至 3.0)（

14、595）为溶剂进行紫外扫描，对照品与供试品在同一波长（243 nm）处有最大吸收，且没有其它干扰，因此选择该溶液作为本文中 HPLC 的流动相。目前，测定维生素 C 含量的方法一般采用电位滴定法4、碘量法3等，但所有这些方法都有标准溶液标定繁琐、操作程序复杂、费时等缺点。本文采用的含量测定方法操作简便，重现性好，精密度高，适合于维生素 C 的含量测定，更适合于灯盏花素注射液的质量监测与控制。笔者曾参照文献5报道的 UV 法测定该批灯盏花素注射液中所添加维生素 C 的含量，其结果为 8.0625 mg/ml,与本文实验数据相一致。【参考文献】1 中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准（中药成方制剂第二十册）M.1998102.2 代 勇，刘三康，付春梅等. 灯盏花素注射液的含量测定及有关物质的检查J.华西药学杂志. 2005，20(2)：147.3 国家药典委员会.中国药典（二部）M.北京：化学工业出版社,2005：669.4 陈秋丽，甘振威，张娅捷等电位滴定法测定蔬菜和水果中的维生索 CJ吉林大学学报(医学版)，2004，30(5)：8215 袁叶飞，甑汉深，欧贤红. 分光光度法测定大枣中的维生素 C 含量J.安徽中医学院学报. 2006.4，25（2）：40.