高效液相色谱法测定蒙药黄花铁线莲中槲皮素的含量.doc

1、高效液相色谱法测定蒙药黄花铁线莲中槲皮素的含量作者：常福厚 齐君 范蕾 韩瑞兰 王敏杰 尹琴 【摘要】 目的测定黄花铁线莲中槲皮素的含量，为蒙药黄花铁线莲中槲皮素的含量提供检测方法，制定质控标准。方法采用高效液相色谱法，Kromasil (250 mm4.6 mm，5 m)色谱柱，甲醇0.4% 磷酸（6040）为流动相，流速为 1.0 ml/min；检测波长 360 nm。 结果槲皮素浓度在 15.35 76.75 g/ml 范围之间与峰面积线性关系良好，r=0.999 6。槲皮素平均回收率为 98.13%，RSD=1.55%。结论采用高效液相色谱法测定黄花铁线莲中槲皮素的含量具有分离效果好、

2、简便、准确等优点。 【关键词】 黄花铁线莲 皮素 高效液相色谱法 含量测定黄花铁线莲为毛茛科植物黄花铁线莲 Clematis intricata Bge.的地上部分，主要分布于内蒙古、辽宁、河北、山西、陕西、甘肃、青海等地,多生于山坡、草地、路边或灌木丛中。 “黄花铁线莲”名称源于其植物名，其作为蒙药“阿拉格-特木尔-敖日阳古”收载于中华医学百科全书 （蒙医分卷） 认药白晶鉴 无误蒙药鉴 内蒙古中草药和内蒙古植物药志 1 中华本草 （蒙药卷）中。主治胃痞、石痞、大肠痞、食痞等寒性痞症。现有研究表明，槲皮素具有抗炎、抗氧化、抗癌和抗突变、抗心肌肥厚和降血压等多种药理作用24 。黄花铁线莲有效成分

3、为槲皮素等黄酮类物质，本实验采用高效液相色谱法测定其中槲皮素的含量，以此方法控制蒙药材黄花铁线莲的质量。1 材料与仪器1.1 材料 黄花铁线莲（采自内蒙古呼和浩特市蛮汉山、小井沟、五一水库，经内蒙古医学院药学院生药学教研室庞秀生教授鉴定为毛茛科植物黄花铁线莲 Clematis intricata Bge.的地上部分） ，方法学考察中均采用蛮汗山所采集到的样品。槲皮素对照品（中国药品生物制品检定所提供，批号：100081-200406） ；甲醇为色谱纯，无水乙醇、磷酸、盐酸等试剂均为分析纯，水为双蒸水。1.2 仪器 依利特 UV-230+高效液相色谱仪(大连依利特分析仪器有限公司): UV-23

4、0+紫外-可见检测器、P230/P230p 高压恒流泵、EC2000 色谱工作站。601 超极恒温水浴（江苏省金坛市医疗仪器厂） ，电子天平（JA2003，上海天平仪器厂） 。2 方法与结果2.1 色谱条件 色谱柱：Kromasil (250 mm4.6 mm，5 m),流动相：甲醇-0.4%磷酸（6040） ；流速：1.0 ml/min；检测波长：360 nm；进样量为 20 l。结果见图 12。图 1 槲皮素对照品 HPLC 图谱图 2 黄花铁线莲 HPLC 图谱2.2 对照品溶液的配制 取 120干燥 4 h 的槲皮素对照品 3 mg，精密称定，置 10 ml 容量瓶中，然后加甲醇至刻度

5、，摇匀，即得（每毫升中含槲皮素 0.307 mg） 。2.3 供试品溶液的制备 取本品 1 g，过 65 目筛，精密称定，加无水乙醇 16 ml，9%盐酸 4 ml，加热回流两次，30 min/次，抽滤，合并滤液，置 50 ml 容量瓶中，加 9%盐酸至刻度，摇匀，即得。2.4 标准曲线的制备 精密吸取 0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 ml对照品溶液分别置于 10 ml 容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。分别吸取20 l 注入高效液相色谱仪，记录峰面积。以对照品溶液浓度为横坐标，对照品峰面积为纵坐标，进行线性回归，标准线性回归方程为Y=89.644X-71.768， r=0.999 6 实

6、验表明槲皮素浓度在 15.3576.75 g/ml 范围内呈良好的线性关系。2.5 精密度实验 取供试品溶液，重复进样 5 次，记录峰面积并计算，结果槲皮素的平均含量为 1.858 7 mg/g，RSD 为 1.11%。2.6 稳定性实验 取黄花铁线莲供试品溶液在0，1，2，3，4，5，6，9 h 分别进样 20 l，记录峰面积，结果 RSD 为1.05%，表明槲皮素在 9 h 内保持稳定。2.7 重复性实验 取同一批供试品 5 份，各约 1 g,精密称定，分别按样品提取方法提取、测定，结果槲皮素品均含量为 1.832 mg/g，RSD为 1.81%。2.8 加样回收率实验 取已知含量的同一批

7、供试品 5 份，各约0.5 g，精密称定，分别加入槲皮素标准品溶液（0.586 mg/ml）1.45 ml，按供试品溶液的方法处理并测定含量，计算加样回收率，结果见表1。槲皮素平均回收率为 98.13%，RSD 为 1.55%,结果表明本方法准确可靠。表 1 样品中槲皮素含量加样回收率实验结果2.9 样品含量测定 取 3 个批次的样品各两份，每份约 10 g，精密称定，按“供试品溶液的制备”项下操作，取 20 l 注入高效色谱仪，以色谱条件测定，计算槲皮素的含量，结果见表 2。表 2 样品含量测定结果3 讨论选定提取溶剂后，在相同水解条件下，分别用水浴回流提取与超声提取处理样品，结果发现槲皮素

8、总含量，水浴回流法比超声提取法高一倍多，说明回流更有利于黄酮类物质的水解，因此选定水浴回流提取的方法5 。为了保证被测成分在回流提取过程中能全部提净，实验研究中对样品提取次数作了考察，结果见表 3。表 3 提取次数的考察实验结果表明加热回流提取 2 次与 3 次的结果基本一致,说明加热回流提取 2 次就可将黄花铁线莲中的槲皮素提取完全。故将供试品的提取次数定为 2 次。波长的选择：用二极管阵列紫外检测器对槲皮素的标准品溶液在波长 190500 nm 范围内进行扫描，发现槲皮素在 210，255 nm 和 360 nm 波长处有特征吸收峰，槲皮素在 360 nm 处灵敏度较高，峰形较好，样品中槲

9、皮素峰能达到基线分离6 。故最后选定检测波长为 360 nm7 。黄酮类成分在测定中易出现拖尾现象，在流动相中可加入磷酸，抑制其拖尾，提高其峰形对称性8 。通过对不同比例的流动相及磷酸浓度的实验选择，结果发现甲醇-水系统比乙腈-水系统分离效果好；甲醇增加可改善峰形，减少拖尾，但甲醇比例过高，分离效果下降，而以甲醇-水(6040)为流动相，分析时间适中；磷酸的比例在 0.1%0.4%之间，都能保证样品的分离，本文比较了甲醇-04磷酸不同比例，结果发现对黄花铁线莲而言，选择现正文所用流动相，待测成分分离较好且峰形最佳。槲皮素为黄酮类化合物，在槐花米、银杏等中均有分布，具心血管方面的生理活性，也是黄

10、花铁线莲中的主要有效成分，因此测定其含量可较好地控制产品质量，保证蒙医用药的安全性与有效性。【参考文献】1 朱亚民.内蒙古植物药志,第卷M. 呼和浩特:内蒙古人民出版社,2000:392.2 俞一心,戈升荣，王桂珍，等.槲皮素及其衍生物的药理作用研究进展J.中药材,2003，26（12）：902.3 谭 君,王伯初,祝连彩，等.槲皮素金属配合物的药理作用研究进展J.中国药学杂志,2006,41(22):1688. 4 吕 蔡.槲皮素的药理作用J.国外医药植物药分册,2005,20(3):108.5 郭朝辉,蒋生祥.高效液相色谱法测定甘肃金银花中槲皮素和木樨草素的含量J.时珍国医国药，2006，17（4）：552.6 王天志,李永梅.金银花的研究进展J.华西药学杂志,2000,15(4):292. 7 张丽静,易新萍,李 革，等. HPLC 法测定新疆贯叶连翘中芦丁及槲皮素的含量J.新疆大学学报（自然科学版）,2007,24（1）:70.8 郭 澄,张 纯,邵元福，等 .测定南方菟丝子中槲皮素和山萘酚的含量J.中国药学杂志,1999,34(2):113.