葛根素对人胚肺成纤维细胞增殖及细胞外基质合成的影响　.doc

1、葛根素对人胚肺成纤维细胞增殖及细胞外基质合成的影响 作者：解克芳 王继峰 牛建昭【摘要】 ：目的 观察葛根素对体外培养人胚肺成纤维细胞增生和凋亡以及细胞外基质形成的影响。方法 用 0400 g/mL 浓度的葛根素作用于体外培养的人胚肺成纤维细胞,2496 h 后观察不同浓度的葛根素对成纤维细胞增殖活性及其功能的影响。MTT 法观察成纤维细胞的生长活性,天狼猩红染色观察胶原生成情况。流式细胞仪测定细胞周期时相变化。结果 80400 g/mL 浓度作用下 2472 h 范围内,葛根素可剂量和时间依赖性地抑制人胚肺成纤维细胞的增生(P0.05)。流式细胞仪检测结果发现,随着浓度的增大,G0/G1 期

2、细胞百分比逐渐上升,S 期细胞百分比逐渐下降,说明细胞阻滞于 G0/G1 期。结论 葛根素可在一定程度上抑制人胚肺成纤维细胞的增生,并诱导其凋亡,降低胶原的合成,作用呈时间和剂量依赖性。 【关键词】 葛根素 人胚肺成纤维细胞 细胞外基质Abstract：Objective To investigate the effect of puerarin on proliferation of human embro fibroblast and extracelluar matrix. Method Human embro fibroblasts were incubated with 0400 g

3、/mL puerarin for 2496 h. The MTT method was used to assay the biological activities and extracelluar matrix formation in different time and different dose of pueratin. The cell cycle distribution was detected by flow cytometric analysis. Result Incubation cells in presence of puerarin of 40400 g/mL

4、for 2472 h could significant inhibit cell proliferation and restrain the collagen synthesis in a dose- and time-dependent manner (P0.05). After treated with puerarin at different concentrations for 24 h, the cell number in G0/G1 phase was increased while in S phase decreased (P0.05). Cells were arre

5、sted in G0/G1 phase. Conclusion Puerarin significantly inhibits proliferation of human embro fibroblast, makes it arrest in G0/G1 phase and restrains the collagen synthesis, which is dose- and time-dependent in vitro.Key words：puerarin；human embro fibroblast；extracelluar matrix肺纤维化是以成纤维细胞增殖及大量细胞外基质(

6、ECM)聚集为特征的病变。肺成纤维细胞的过度增生和分泌胶原在肺纤维化形成过程中扮演了重要的角色。因此,寻找有效药物抑制肺成纤维细胞的过渡增生是防治肺纤维化的重要手段之一。本实验观察了葛根素对人胚肺成纤维细胞增殖及 ECM 的影响。现报道如下。1 材料与方法1.1 主要试剂及仪器人胚肺成纤维细胞 MRC-5,中国协和医科大学基础医学院细胞中心；MEM/NEAA 培养液,中国协和医科大学基础医学院；胰酶,美国 Sigma 公司产品；葛根素标准品(分析纯,含量99%),中国药品生物制品检定所；胎牛血清,Gibco 公司产品；噻唑蓝(MTT),北京科海军舟有限公司；0.1%天狼猩红苦味酸染液,北京海德

7、生物公司。生化培养箱，SANYO 公司；酶标仪、流式细胞仪,均为美国 B.D 公司产品。1.2 葛根素溶液的配制以少量二甲基亚砜(DMSO)溶解后,加入 MEM/NEAA 配制成 400 g/mL 贮存液,-20 闭光保存,2 周内有效。使用时用 DMEM/NEAA 培养液稀释至所需浓度(DMSO 终浓度小于 1,在本实验条件下 1DMSO 对培养人胚肺成纤维细胞 MRC-5 无明显影响)。1.3 细胞的培养MRC-5 细胞生长于含 10%FBS、100 g/mL 青霉素、100 g/mL链霉素的 MEM/NEAA 培养液中,于 37 、5% CO2、饱和湿度的 CO2 孵育箱中培养,24 h

8、 后进入对数生长期,96 h 长满瓶底,34 d 更换 1 次培养液。1.4 葛根素对 MRC-5 增生的影响采用 MTT 法检测。取对数生长期的 MRC-5 细胞胰酶 37 消化 5 min,以10%胎牛血清的 MEM/NEAA 培养液制备成 1105/mL 细胞悬液,接种于 96孔培养液板中,每孔 200 L,置于 37 、5% CO2 及饱和湿度的培养箱中培养,至细胞长至单层后,分别在细胞中加入不同浓度的葛根素,同时设不加药的阴性对照和只加培养液的空白对照,每组设 4 个复孔。分别继续培养 24、48、72、96 h 后,每孔加入 20 L MTT 继续培养 4 h,弃上清,加入 200

9、 L DMSO,微量震荡 10 min,使 MTT 完全溶解,于自动酶标仪在 570 nm 波长处测定各孔吸光度 A 值,实验重复 3 次。1.5 流式细胞仪测定细胞周期时相变化取对数生长期的细胞,以 5105/mL 密度接种于 25 mL 培养瓶中,24 h 后换无血清 MEM/NEAA 培养液继续培养 24 h,换用不同浓度的 40400 g/mL 葛根素分别作用 24 h。对照组不加药,收集贴壁细胞,4 预冷的PBS 洗涤 2 次,制成单细胞悬液,70%乙醇固定,4 保存过夜,-20 保存,1 周有效。检测前用 PBS 洗去固定液,加入 20 L RnaseA,37 孵育 30 min

10、后,暗处加 PI 染液,冰浴 30 min,染色后以 300 目筛网过滤。调整细胞浓度为 1105/mL,上流式细胞仪检测,作细胞周期分析。1.6 胶原的检测1采用 MTT 法检测。取对数生长期的 MRC-5,用 MEM/NEAA 培养液调整细胞数为 1105/mL,接种到 96 孔培养板中,每孔 200 L,37 、5% CO2及饱和湿度的培养箱中培养,12 h 后换用无血清培养液,24 h 后换用含不同浓度葛根素培养液,另设不加药的正常对照组,每组设 4 个复孔。分别培养 24、48、72、 96 h 后吸去培养液,每孔加甲醇 100 L,-20 固定一夜,PBS 洗 1 次,天狼猩红室染

11、 1 h,0.1%醋酸洗 3 次,每孔加入 0.1 mol/L 20 L,室温震荡 1 h,于酶标仪 540 nm 处检测。1.7 统计学方法采用方差分析及 t 检验,实验数据采用统计软件 SPSS10.0 处理,MTT 实验结果以xs 表示,P0.05 认为有显著性差异。2 结果2.1 葛根素对体外培养人胚肺 MRC-5 细胞增殖的影响(见表 1)表 1 葛根素对体外培养人胚肺 MRC-5 细胞增殖的影响(略)注：与对照组比较,*P0.05,*P0.01(下同)MTT 结果：葛根素浓度80 g/mL 时能显著抑制 MRC-5 生长(P0.05)。40400 g/mL 的浓度范围,抑制强度随浓

12、度升高而加强(P0.05)。药物作用时间 2496 h,抑制强度随时间延长而加强(P0.05)。96 h 时葛根素 400 g/mL 对人胚肺 MRC-5 细胞增生抑制作用显著(P0.01)。2.2 镜下观察葛根素处理后细胞形态的变化对照组细胞：密度低时,细胞长梭形或三角形,有多个细胞质突起；细胞密度高时,以长梭形为主,排列紧密,放射状或涡旋状,边界不清。用药组细胞：胞体收缩,细胞变圆,细胞间隙增宽,分布松散；胞质内颗粒状物增多；高剂量时部分细胞死亡破碎浮起。2.3 胶原测定结果随着葛根素浓度的增加,吸光度越来越小,当浓度200 g/mL时,与正常组相比较具有显著差异。这可能说明葛根素首先抑制

13、细胞的生长,而抑制胶原合成是继发的现象。结果见表 2。表 2 胶原测定结果（略）2.4 流式细胞仪检测细胞周期实相的分布检测结果显示,正常对照组细胞其 G0/G1 期细胞百分比 76.56、80 g/mL 的葛根素处理细胞其 G0/G1 期细胞百分比为 84.72。由检测结果可知,随着浓度的增大,G0/G1 期细胞百分比越来越大,说明细胞阻滞于G0/G1 期,而进入 DNA 合成期的细胞减少。3 讨论肺纤维化是多种原因引起的慢性肺疾病的共同结局,是多种肺疾病发展到晚期的共同病理变化。其集中表现为成纤维细胞的异常增殖和细胞外基质的过度沉积,在肺部,细胞外基质的主要成分之一胶原即来自于活化的成纤维

14、细胞。由于纤维细胞的异常增殖及胶原的分泌增加在肺纤维化过程中起着重要作用2,因此,抑制肺纤维细胞增殖是防治肺纤维化的一种有效手段。本实验以人胚肺成纤维细胞为靶细胞,研究葛根素对成纤维细胞增殖、形态学及胶原表达的影响。结果发现,葛根素能显著抑制其增殖活力及DNA 合成,将细胞阻止在 G0/G1 期,并呈剂量依赖性；随着剂量的递增,其抑制作用也明显增强。提示其可能有预防或延缓肺纤维化疾病进程的作用。有研究表明,在肺纤维化的发生发展过程中,、型胶原合成与降解失衡起主要作用,在肺泡炎阶段或肺纤维化早期主要以型胶原增加为主,此期病变尚可逆转,随后病变转为慢性,则以型胶原沉积为主,形成不可逆转的改变3-4

15、。天狼猩红能与胶原紧密吸附,反应极其稳定,染色后不褪色,具有特异性,是目前胶原染色最好的染料。在普通光镜下观察,胶原纤维呈红色。本实验通过天狼猩红染色发现葛根素组胶原表达明显减弱。综上所述,葛根素可抑制人胚肺成纤维细胞增殖,使细胞周期停滞于 G0/G1 期,同时能减少胶原纤维的形成。提示葛根素可能通过抑制肺成纤维细胞增殖及胶原的合成分泌而起到抗肺纤维化作用。【参考文献】1 Branton MH, Kopp JB. TGF1 and fibrosisJ. Microbes Infect, 1999,1：13491365.2 赵洪文.肺成纤维细胞在肺纤维化中的作用J.国外医学呼吸系统分册,1996,16(3)：116117.3 侯 杰,戴令娟.川芎嗪、丹参治疗大鼠肺纤维化对、型前胶原基因表达的影响J.中华结核和呼吸杂志,1999,22(1)：4344.4 何玉先,刘秉慈.实验性矽肺纤维化组织中、型前胶原基因的表达J.基础医学与临床,1994,14(6)：4346.