培养标本处理.ppt

1、培养前标本处理篇,标本采集处理,血液培养相关问题脑脊液相关问题粪便相关问题生殖道标本相关问题脓,吸出液及组织标本相关问题痰标本相关问题咽标本相关问题真菌培养相关问题尿标本相关问题,血培养主要病原菌：沙门菌、布氏杆菌、其他革兰阴性杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血杆菌以下菌应视为非病原菌(除非1次血培养分离出)：芽孢杆菌属、凝固酶阴性葡萄球菌、草绿色链球菌、棒状革兰阳性杆菌,从两个独立的皮肤位点采血，每瓶采集10ml,#1,35C 空气中孵育5天每天检查浊度并翻转培养瓶,#2,#3,18小时后传进行次代培养当培养瓶显示细菌生长时进行革兰染色和传代培养,革兰阳性球菌接种血平皿奥普托欣试验,

2、革兰阴性杆菌接种血平皿和麦康凯平皿,革兰阴性双球菌或球杆菌接种巧克力平皿和血平皿,CO2中孵育72h,#5,#4,将重要的革兰染色结果尽快通知临床医生,对重要病原菌进行鉴定和药敏试验,#6,例如：肺炎克雷伯菌,例如：肺炎链球菌, Ellen Jo Baron 2007; Use with proper attribution,血培养是诊断败血症最有价值的手段,败血症是一个非常严重的问题.血液中的微生物在3分钟内到达每个器官.在死于败血症的患者中,尽管采用抗生素给与合适的治疗，1/4的人死亡时，血中循环的微生物为10/cc或更少,Septicemia,微生物或其产物在血液中引起疾病,循环的 CF

3、U/ml vs. 病原体,成人 (12 岁):, 1 CFU/ml,金黄色葡萄球菌,27%,铜绿假单胞菌,55%,大肠埃希菌,62%,其他菌种,40%,From Mayo Clinic, Boston City Hosp., National Childrens Hosp., Univ. of Washington, Seattle.,循环的 CFU/ml vs. 病原体,儿童:, 5 CFU/ml,任何病原体,19%, 10 CFU/ml,任何病原体,27%,新生儿:, 4 CFU/ml,大肠埃希菌,26%,From Mayo Clinic, Boston City Hosp., Natio

4、nal Childrens Hosp., Univ. of Washington, Seattle, York Hosp., York, PA., 2 小时短期插管 81% 敏感性 & 92% 特异性长期插管 93% 敏感性 & 75% 特异性,不需要拔掉导管-阳性报警时间,Raad, I. et al. 2004. Ann. Int. Med. 140:18.6138 份即时血培养; 191份两个血培养瓶中鉴定的细菌相同 (25份不同). 108 (1.8 %) 有导管相关性感染; 9.8% 仅仅只有CVC培养阳性.,Maki 滚动法,导管尖阳性培养结果,导管血在外周血阳性之前2 小时内阳性

5、 报告: CVC不可能是菌血症的来源2.导管血在外周血阳性 2 小时之前阳性 报告: CVC 可能是菌血症的来源3. 只有其中一瓶报警阳性 (如果所有瓶子中的血量足够)报告: 可能污染; 患者无菌血症,根据阳性报警时间判读,污染细菌,血培养污染定义为在几次血培养中单个血培养下列细菌阳性:凝固酶阴性葡萄球菌棒状杆菌 微球菌丙酸杆菌 芽孢杆菌,血培养污染 vs. 皮肤消毒,% 污染,Studies from Baylor, Nashville, & France,败血症 vs. “污染的” 血培养,%,阳性,Mayo Clinic Study,心内膜炎,菌血症,皮肤定植细菌,#血培养套数,脑脊液（

6、CSF)培养主要病原菌：B群溶血链球菌（新生儿），流感嗜血杆菌（2月-2岁儿童），肺炎链球菌，脑膜炎奈瑟氏菌,最少1ml，最佳5ml,医生通过无菌皮肤穿刺采集脑脊液（腰椎穿刺）于无菌管中。第二管和第三管用于微生物学检测。,# 1,1500g离心15分钟（可能的话）,# 2,# 3,用吸管吸去上清，留下1cc的脑脊液沉淀,X,注意：不要倾倒,# 4,滴一滴沉淀于巧克力平皿和血平皿,上下吸取10次以上混匀沉淀,# 5,CO2中孵育72小时,# 6,将一大滴沉淀滴在玻片上。不要涂开。自然干燥并进行革兰染色。如见到大量多形核白细胞则强烈支持感染,# 7, Ellen Jo Baron 2007; Us

7、e with proper attribution,脑脊液（CSF)培养主要病原菌：B群溶血链球菌（新生儿），流感嗜血杆菌（2月-2岁儿童），肺炎链球菌，脑膜炎奈瑟氏菌,最少1ml，最佳5ml,医生通过无菌皮肤穿刺采集脑脊液（腰椎穿刺）于无菌管中。第二管和第三管用于微生物学检测。,# 1,1500g离心15分钟（可能的话）,# 2,# 3,用吸管吸去上清，留下1cc的脑脊液沉淀,X,注意：不要倾倒,# 4,滴一滴沉淀于巧克力平皿和血平皿,上下吸取10次以上混匀沉淀,# 5,CO2中孵育72小时,# 6,将一大滴沉淀滴在玻片上。不要涂开。自然干燥并进行革兰染色。如见到大量多形核白细胞则强烈支持感

8、染,# 7, Ellen Jo Baron 2007; Use with proper attribution,#1,#2,接种血平皿，麦康凯平皿，Hektoen或DCA，若怀疑弧菌则还接种TCBS平皿。37 C 空气孵育48h,#3,粪便标本采集后30分钟内进行接种或置于cary-blair运输培养基中,#4,粪便培养重要的病原菌：沙门菌、志贺菌、弯曲杆菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、产毒性大肠杆菌&难辨梭菌（在常规的实验室可能检测不出）,选择血性或脓性的部分进行接种,血平皿上氧化酶阳性的革兰阴性杆菌需进一步鉴定将菌落接种TCBS或含0-6盐浓度的肉汤中。,麦康凯、HEK或DCA平皿上不利用乳糖的

9、革兰阴性杆菌需进一步鉴定。,氧化酶阳性、湿润的米色菌落,革兰染色显示弯曲或螺旋形的杆菌弯曲杆菌属,Campy琼脂,#6, Ellen Jo Baron 2007; Use with proper attribution,#5,将菌落接种至Campy琼脂或使用滤纸法。微需氧环境下37-42 C 孵育 72 h,CO2孵育72h TM培养基上寻找淋球菌，血平皿上寻找酵母菌,# 2,血平皿& Thayer-Martin平皿,# 1,# 1,接种Thayer-Martin培养基&革兰染色,将拭子在玻片上滚动制成一个细胞厚度的涂片；寻找“线索细胞”,C. 怀孕35-37周的孕妇阴道或肛拭子,营养肉汤中孵

10、育过夜血平皿上次代培养检测B群链球菌,# 1,# 2,CO2中孵育48小时,D. 女性的阴道拭子,# 1,血平皿上寻找酵母菌，T-M培养基上寻找淋球菌,革兰染色辅助诊断细菌性阴道病,# 1,# 2,30 min内将拭子置于0.5ml生理盐水中检测滴虫,T-M培养基上的淋球菌,血平皿上的酵母菌,A. 女性的子宫颈或肛拭子,B. 男性的尿道拭子,生殖道标本培养主要病原菌：淋病奈瑟菌，滴虫，酵母菌&女性的细菌性阴道病综合征，孕妇携带的B群溶血链球菌, Ellen Jo Baron 2007; Use with proper attribution,阴道感染的病因学,From a major U.S.

11、 Ob/Gyn department.,衣原体,混合性传播疾病,念珠菌,女性百分比,细菌性阴道炎,正常,女性生殖道感染的症状和致病菌,子宫颈炎,阴道炎,其他,细菌性阴道炎,念珠菌,阴道毛滴虫,衣原体,淋病奈瑟菌,支原体/脲原体,损伤:单纯疱疹人乳头瘤病毒梅毒螺旋体触染性软疣,痰标本主要病原菌：肺炎链球菌，克雷伯菌属，流感嗜血杆菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌。非病原菌：酵母菌，草绿色链球菌，凝固酶阴性葡萄球菌,病人需用水清洁口腔，深咳肺部痰，不要唾液,#1,进行革兰染色以评价标本是否适于接种。向临床医生尽快报告重要的革兰染色结果,#2,#3,好：很少扁平上皮细胞,奥普托欣纸片,CO2中孵育48

12、小时,#4,接种巧克力平皿，血平皿和麦康凯平皿,#5,拒绝：大量 扁平上皮细胞,肺炎克雷伯菌,对重要病原菌进行鉴定&药敏试验,金黄色葡萄球菌,肺炎链球菌,胆汁溶菌, Ellen Jo Baron 2007; Use with proper attribution,奥普托欣,流感嗜血杆菌,有意义的细菌浓度值（CFU/ml）,标本,有意义的浓度 CFU/ml,自然咳痰,107,诱导痰,不确定,气管内吸取物,106,支气管肺泡灌洗液,104,保护性毛刷,103,支气管灌洗液,不做培养,气管内吸取物,加等量的N-乙酰-L-半胱氨酸或溶痰剂,漩涡震荡30s,加0.01ml标本至1.0ml的TSB,每个平

13、板涂0.01ml,血平皿,巧克力平皿,麦康凯平皿,1：100稀释,1：2稀释,生长出50个菌落,支气管肺泡灌洗液,将所有标本装入50ml离心管内,离心20min，混匀10ml沉淀液，漩涡震荡30s,每个平板涂0.01ml,血平皿,巧克力平皿,麦康凯平皿,Use pipette.用吸管吸取0.1ml至1mlTSB（1：10稀释）,生长出10个菌落,制作涂片（细胞离心),保护性毛刷,将毛刷置于1ml稀释液中,震荡30s,每个平板涂0.01ml,血平皿,巧克力平皿,麦康凯平皿,生长出10个菌落,Use PRAS if anaerobic若怀疑厌氧菌则使用PRAS,制作涂片（细胞离心),脓，吸取物或组

14、织标本主要病原菌：金黄色葡萄球菌，化脓链球菌，其他溶血链球菌，铜绿假单胞菌，其他革兰阴性杆菌。非病原菌：凝固酶阴性葡萄球菌，少量的棒状革兰阳性杆菌,用酒精消毒伤口 周围皮肤最好的标本是吸取物和组织最差的标本是拭子,#1,接种血平皿和麦康凯平皿如果是吸取物或组织，进行革兰染色，将重要结果通知临床医生,#2,#3,铜绿假单胞菌,中孵育48小时,#4,对1或2种重要病原菌进行鉴定&药敏试验,金黄色葡萄球菌为主,溶血链球菌,肺炎克雷伯菌,混合的2种肠道革兰阴性杆菌：2种均报告；,当检出3种或更多病原菌时，报告“混合菌丛”并描述性列出假单胞菌，金葡菌，变形杆菌，肠道革兰阴性杆菌等。, Ellen Jo

15、Baron 2007; Use with proper attribution,#5,咽部标本培养 主要病原菌：A群溶血链球菌。 选择性报告：溶血隐秘杆菌,拭子擦取咽部和扁桃体。不要碰触舌头和面颊。,将拭子擦拭血平皿（羊血或马血）的1/5区域,在第一区贴相邻的两纸片：复方磺胺和杆菌肽,# 1,拭子,# 2,在烛缸中37C孵育过夜并检查平板；若阴性，继续孵育过夜总孵育时间48小时,# 5,# 3,分区画线3或4区,接种环,溶血菌落， 0.5 mm, 对复方磺胺耐药，对杆菌肽敏感A群链球菌（触酶阴性）,# 6,杆菌肽& SXT 纸片,# 4,杆菌肽,复方磺胺,PYR阳性可确证A群链球菌,# 7,

16、Ellen Jo Baron 2007; Use with proper attribution,不要报告咽炎中非致病菌：金黄色葡萄球菌肺炎链球菌流感嗜血杆菌卡他莫拉菌溶血链球菌所有革兰阴性杆菌所有酵母菌,报告结果： 1+ to 4+ A群溶血链球菌 或1+ to 4+ 非A群溶血链球菌 或未检出溶血链球菌,# 8,# 9,#1,#2,常规：接种沙氏平皿和Mycobiotic培养基。 30 C 空气孵育四周。对于皮肤癣菌：接种Mycobiotic和DTM培养基组织，皮肤刮取物或指甲：将一小块完整的标本插入琼脂表面,#3,重要的真菌：组织活检，痰，脑脊液，血培养皮肤癣菌：皮肤刮片，指甲刮片，根部

17、的头发不要研磨组织：使用解剖刀将其切成小块,#4,真菌培养 重要病原菌：新型隐球菌，人芽囊原虫 ，皮肤癣菌，和 其他真菌（考虑标本来源和病人情况）,拭子仅用于酵母菌的分离接种血平皿和沙氏平皿, Ellen Jo Baron 2008; Use with proper attribution,#6,将标本研于一滴10%KOH，加盖玻片后镜检真菌,接种后7天内每日观察平皿，之后每周两次,光滑菌落酵母菌毛状菌落丝状真菌,用通气胶带粘贴平皿的侧面或两边,#5,#1,b,a,b,Urine Culture尿培养主要病原菌：大肠埃希菌，变形杆菌，克雷伯菌，其他革兰阴性杆菌，肠球菌，腐生葡萄球菌，纯的金黄色

18、葡萄球菌,#2,接种血平皿和麦康凯平皿,#3,空气孵育24小时,收集中段尿,a,#4,菌落计数,0.001ml接种环,若 2 种菌生长，对每种菌进行鉴定和药敏试验；若2种菌生长，报告“混合菌群”,#5,注意:,革兰阴性杆菌在血平皿和麦 康凯平皿上均生长良好革兰阳性球菌仅在血平皿上生长良好,GNR,#6,75,000 cfu/ml,50,000 cfu/ml,100,000 cfu/ml, Ellen Jo Baron 2007; Use with proper attribution,GPC,尿道感染,每年850万例尿路感染, 90%为女性1/2.5个妇女在一生中会得UTI下行性感染：血流肾脏

19、膀胱（金黄色葡萄球菌，酵母菌，结核分枝杆菌）上行性感染：尿道膀胱肾盂 血流,尿培养的划线方式,第一区 = 50,000 cfu/ml第二区= 75,000 cfu/ml第三区= 100,000 cfu/ml,沿中心线向下= 50,000 cfu/ml长向边缘= 100,000 cfu/ml,蛋白胨，酵母提取物，色原物,显色培养基,大肠埃希菌,肠球菌,无乳链球菌,腐生葡萄球菌,同样的接种物在显色培养基（BBL）上生长,大肠埃希菌，肠球菌和变形杆菌在血平皿上生长,CHROMagar Orientation,Stanford 培养皿,大肠埃希菌,肠球菌,肠杆菌属,Stanford 培养皿,大肠埃希菌，克雷伯菌和变形杆菌,大肠埃希菌,chromID CPS- 生物梅里埃公司的产品快速鉴定大肠埃希菌，变形杆菌和肠球菌,可分离所有尿道病原菌更好的可操作性更好的鉴定能力更高的可靠性,微生物的列举用10ul的校准接种环接种菌尿的解释 105菌落单位/ml : 可能为感染比较菌落密度如下图所示(CFU = 菌落形成单位),chromID CPS,评价尿培养的标准,