短穗竹丛枝病病原的形态学及分子鉴定.DOC

1、短穗竹丛枝病病原的形态学及分子鉴定程燕林 1，李向敏 1，侯成林 1，高健 2*（1.首都师范大学生命科学学院，北京 100037；2.国际竹藤网络中心，国家林业局竹藤科学与技术重点实验室，北京 100102）摘要：丛枝病是竹类常见的真菌病害之一，在我国分布极广，对竹林危害严重，研究丛枝病的病原对竹林的病虫害防治有着重要的意义。本病可由多种病原引起，竹香柱菌即是其中之一。竹香柱菌包括箬竹香柱菌（Epichlo sasae）和箣竹香柱菌（Epichlo bambusae）两种，目前国内对这两种菌都有记载，但均不详细，尤其对 Epichlo sasae 更未见对其深入研究。笔者从安徽省广德县采集到

2、患香柱型丛枝病的短穗竹，对其病原菌的形态学和培养特征进行观察，并对其进行了分子系统学分析，最终确定该菌为 Epichlo sasae，并依据 Eiji Tanaka (2002) 年的研究结果将其更名为箬竹异香柱菌 Heteroepichlo sasae。关键词：短穗竹；丛枝病；竹香柱菌；系统发育分析Identification of the pathogen of witches broom on Brachystachyum by morphology and phylogenyCheng Yan-lin, LI Xiang-min, HOU Cheng-lin, GAO Jian(1.

3、College of Life Science, Capital Normal University, Beijing 100037, P. R. China; 2. International Center for Bamboo and Rattan, SFA Key Laboratory on Bamboo and Rattan Science and Technology, Beijing 100102, P. R. China)Abstract: Witches broom is one of the common diseases by fungi,which is widespre

4、ad in China. It is dangerous to the bamboos. So it is significant to study the pathogen of witches broom for control. This disease can be caused by several kinds of pathogen. Epichlo spp. are the examples of them, which include Epichlo sasae and Epichlo bambusae. The author collect some branches of

5、Brachystachyum sp. which suffered from Epichlo-Witches broom, and investigate its pathogen deeply and systematically. It is finally determined to be Epichlo sasae by morphological, cultural and phylogenetic character, and is renamed to Heteroepichlo sasae according to Eiji Tanaka (2002).Key words: B

6、rachystachyum; witches broom; Heteroepichlo sasae; phylogenetic analysis竹子属禾本科竹亚科植物，全球约有 78 属，1400 多种 1，中国约有 39 属，500 余种 2。中国是世界上竹资源最丰富的国家之一，也是竹子起源的中心，其竹林总面积超过 500 万 hm2，占全球竹林面积的 1/4 左右 3。竹子在中国主要分布于 40N 以南地区，除新疆、内蒙古和黑龙江外，其它各地均有生长，主要集中在安徽、浙江、福建、湖北、湖南、广东、广西、云南、基金项目：国家林业局“948”项目（2006-4-71）*通讯作者四川和台湾等地。

7、自古以来，竹子与人们的衣、食、住、行密切相关，具有重要的社会和经济价值。此外，一些作为观赏植物的竹子，在生态保护和环境的改善与美化方面发挥了巨大的作用。短穗竹（Brachystachyum spp.）是我国特有属，又称苦竹, 主要分布于江苏、浙江、安徽、江西等省，湖北、福建、广东等地有少量分布 4-6，具有食用、生态和重要的科研价值 7。丛枝病是竹类常见的真菌病害之一，也称竹扫帚病，雀巢病或竹疯病，目前已知是由多种病原引起的小枝丛生的现象。丛枝病最早是1908年Miyake报道 9，之后他和Hara 10 、Hino 11描述了该病的症状，并对引起该病的病原菌Aciculosporium ta

8、ke I. Miyake作了形态学研究，后来Shinohara用柯赫氏法则验证了此病原的致病性 12,13。此后各国研究者相继报道了各地的竹类丛枝病并研究了各自的病原 14-16。在我国，大部分竹产区都有过关于各类竹丛枝病的报道，并描述了发病症状，调查研究了各自的病原 17-23。据目前各地的报道，引起丛枝病的病原有多种，除由MLO（即类菌原体 18,19,24，1994年后称作植原体 23,25）和竹小蜂及介壳虫引起的外 26,27，其余的均由真菌引起的，可据其分为以下几类：第一类称作丛枝型，由竹瘤痤菌(Aciculosporium take I. Miyake:无性型为Albomyces

9、take I. Miyake即 Balansia take Miyake et Hara 或Aciculosporium sasicola Oguchi 28 )引起；第二类称作香柱型，由竹香柱菌(Epichlo bambusae Pat或Epichlo sasae Hara)引起，根据Tanaka的研究 29，将其更名为Heteroepichlo bambusae (Pat.) E. Tanaka和Heteroepichlo sasae (Hara) E. Tanaka；第三类称作叶枯型，由竹暗球壳菌( Phaeosphaeria bambusae Miyake et Hara)引起；第四类

10、为黑粉型，也称作黑粉病，由竹黑粉菌（Ustilago shiraiana P. Henn）引起。.我国普遍发生的竹子丛枝病是由竹瘤痤菌(B. take)引起的，朱熙樵等 ,30-32对此病菌作了较系统的研究，并通过柯赫氏法则验证该菌的致病性，此外，朱熙樵也对叶枯型和黑粉型丛枝病的病原作了生物学特征的研究 33,34。目前国内对于竹香柱菌引起的丛枝病研究甚少，朱熙樵 26曾报道在我国江苏、浙江等省的短穗竹和刚竹属的淡竹、白哺鸡竹及毛竹上采集到竹香柱菌（E. bambusae，即 H. bambusae）的标本，王华清等 35对广东省毛竹丛枝病作过报道，并调查研究了竹香柱菌（E. bambusae

11、，即 H. bambusae）；对另一种竹香柱菌 E. sasae(即 H. sasae)，国内目前只有张立钦 36，徐梅卿等 37 记载过该菌能引起箬竹(Indoca lamus tessella tes (Munro) Keng f.)丛枝病，但具体省份不详，也未见关于此菌的相关研究。本试验对采自安徽短穗竹上的一种香柱菌的形态特征及培养特征进行了研究，并用 rDNA-ITS 分析该菌的系统学位置。一、材料和方法1、试验材料试验材料是 2007 年 5 月底在安徽省广德县竹园采集到的有真菌子座的短穗竹叶鞘部。同时为了探讨试验菌株的系统位置，从 GenBank 上下载了相关种的 ITS 序列（

12、表 1）。表 1. 下载序列的信息Table 1. Information of sequences obtained from GenBank菌株名称 登录号 寄主 来源Heteroepichlo bambusae Ba-01 AB065426 Gigantochloa sp. Indonesia:BandungHeteroepichlo bambusae Le-01 AB065427 Gigantochloa sp. Indonesia:LembangHeteroepichlo bambusae Bo-01 AB065428 Gigantochloa sp. Indonesia:Bogor

13、Heteroepichlo bambusae Bo-02 AB065429 Gigantochloa sp. Indonesia:BogorHeteroepichlo sasae-K AB065430 Sasa sp. Japan:KyotoHeteroepichlo sasae-N AB065431 Sasa sp. Japan:NaganoHeteroepichlo sasae-H AB065432 Sasa sp. Japan:HokkaidoAciculosporium take Nezasa AB065422 Pleioblastus gramineus Japan:KyotoAci

14、culosporium take Ue AB065423 Phyllostachys bambusoides Japan:KyotoAciculosporium take Ginmei AB065424 Phyllostachys bambusoides Japan:Tokyovar.castillonis-inversaAciculosporium take B1 EF363682 Mao bamboo China:GuangxiAciculosporium take B2 EF363683 Mao bamboo China:GuangxiBalansia henningsiana BHU5

15、7404 Andropogon virginicus Athens, Georgia, USABalansia obtecta DQ119113 Convolvulaceae GermanyBalansia cyperi CBS 774.88 DQ119112 Convolvulaceae GermanyBalansia pilulaeformis AF065611 Chasmanthium sp. USABalansia andropogonis BAU89370 Cyrtococcum oxyphyllum India: Kamat in MysoreEpichlo elymi DQ899

16、096 Elymus Canadensis USAEpichlo sp. TC1 AM489766 Brachypodium phoenicoides Spain:ZamoraEpichlo baconii AJ490939 Agrostis castellana Spain:SalamancaEpichlo amarillans AF385206 Agrostis hiemalis USA:MontgomeryNeotyphodium uncinatum APEURNAG tall fescue grass USANeotyphodium typhinum var. AF176260 Ann

17、ual ryegrasses New Zealandcanariense Lc4Neotyphodium occultans AF176265 Annual ryegrasses New ZealandMetarhizium flavoviride NHJ11618 AY646376 HK,ChinaMetarhizium anisopliae var. EF113341 China:Hainananisopliae Mb7 Myriogenospora atramentosa MAU57407 Andropogon virginicus Athens,Georgia, USA Myrioge

18、nospora atramentosa MAU57406 Erianthus contortus Athens,Georgia, USAClaviceps cynodontis DQ187312 Cynodon dactylon USA:Logan County,OK注：“-”表示无记录信息2、试验方法2.1 形态学研究2.1.1 形态观察 观察采集到的新鲜子实体的颜色、大小及质地；作真菌子座横截面的徒手切片，观察真菌的子囊壳、子囊及子囊孢子。2.1.2 分离培养及培养特征的观察取新鲜子实体切成 13mm 左右大小，作常规组织分离。即用 75%的酒精浸润二、三秒钟后，用 10%次氯酸钠消毒 3

19、 5 分钟，最后用无菌水漂洗。稍微控干后移植于 PDA 平板上，分别于 20和室温下培养，观察生长状况。2.2 不同营养对其生长的影响2.2.1 不同培养基对其生长的影响将 PDA 上培养出来的菌丝体，分别接种于 Czapek、CM 及 PDA 培养基上，20，25以及室温下避光培养 29，观察生长状况并比较菌落大小。2.2.2 不同碳源对其生长的影响用 PDA 作基本培养基，分别用蔗糖、麦芽糖和淀粉代替葡萄糖作为碳源，其它成分相同，25避光培养。观察菌落生长状况并比较生长速度。2.3 分子系统学研究2.3.1DNA 提取及测序分别提取真菌子囊果和平板菌丝体的基因组 DNA，所用试剂盒为 OM

20、EGA 公司 的E.Z.N.A 真菌提取试剂盒。PCR 的引物为 ITS1F（5-CTTGGTCATTTTAGAGGAAGTAA-3 ）/ITS4（5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3 ）从子囊果中提取的 DNA 的扩增体系为：plate 0.5l，primer1/2 （25M each）0.5l，2 MasterMix 12.5l ，加 ddH2O 至 25l（参考天根公司2 Taq PCR MasterMix 体系）；从菌丝体提取的 DNA 扩增体系为：10 buffer(不含 Mg2+) 5l, dNTPs (2.5mM each) 4l, primer1/2 (25 M e

21、ach) 1l, plate 4l, MgCl2(25mM) 2.5l,TaqE(2.5U) 0.1l,加 ddH2O 至 50l（参考大连宝生物 Takara Taq 体系）。PCR 条件均为 94预变性 3min, 35 个循环中，94变性 30s，50退火 45s, 72延伸 1min, 最后 72延伸 7min。产物于 4保存，0.8% 琼脂糖凝胶，92V，40min 电泳检测后，委托上海英骏生物技术有限公司测序。2.3.2 分子系统学研究分别从子囊果和菌丝体提取 DNA，PCR 扩增后测序所得双向 ITS 序列是一致的，将其中一个进行手工校正后，用 DNAMAN、EditSeq 等软

22、件拼接。在 GenBank 中 Blast 后，搜索并下载部分同源序列（表 1），表中所有种均属于麦角菌科(Clavicipitaceae)成员。用 Clustalx 1.83和 MegAlign 整理比对后，以 Claviceps cynodontis 为外类群，用 PAUP* 4.0b10 进行系统发育学分析，构建 MP 和 ML 树，采用 Bootstrap 法评估各节点支持率。二、结果与分析1症状子座包裹着叶鞘成开口圆筒状，大多弯曲细长，往端部渐细，深紫色至黑色，长约27cm，新鲜时肉质，风干后革质（图 1）。图 1 子座 图 2 子囊壳Figure 1 Stroma Figure2

23、Perithecium图 3 子囊 图 4 子囊头部Figure 3 Ascus Figure 4 Tip of ascus图 5 分孢子 图 6 纯培养的菌落形态Figure 5 part-ascospores Figure 6 Culturing colony2病原菌的形态特征子囊壳椭圆形或卵形，有规律地埋生于子座外围，300380 120200 ，成熟时朝子座外表面产生一个孔口（图 2）；子囊长圆筒形，顶端头部浑圆加厚，尾端较细，大小为 175250 58 （图 3，图 4）；子囊孢子线形，与子囊几乎等长，无色透明，多分隔且极易断裂成分孢子，分孢子哑铃形，长 1017.5 （图 5）。与

24、前人的记载结果基本一致（表 2）：表 2 不同记载中病原菌的比较Table 2 Comparison of pathogen from several records种类 子座 (cm) 子囊壳( ) 子囊( ) 子囊孢子() 分孢子()H.bambusae Tanaka E29 10(微黄色) 125 6* E.sasae Hino I38 215(紫色) 100160 250340 240350 67 200300 12 9.122.8魏景超 39 1.54.0( 暗黑色) 110200 250350 200250 67 190240 11.5 本研究 27 120200 300380 1

25、75250 5 8 1017.5注：“”表示未记载；“*”表示平均值3病原菌的培养特征常规组织分离培养 21 天后，观察平板上开始出现菌丝，30 天后测量菌落直径大小约为26.80 mm，质地为白色疏松丝状，生长缓慢（图 6）；且观察发现 20、25和室温下培养的菌落大小几乎相等。同等条件下，将菌丝分别接种于 Czapek、CM 及 PDA 上培养。 15 天后该菌在 25培养的CM 和 PDA 上出现菌丝，而 Czapek 上未发现菌丝，进一步观察发现，该菌在此三种培养基上的生长速率： CM PDACzapek，在 Czapek 上不生长。在不同碳源的 PDA 培养基上培养 15 天后，每隔

26、两天测一次各培养基上生长的菌落平均直径并比较数据如图 7，观察发现该菌在葡萄糖为碳源的 PDA 培养基上的生长明显超过其它几种碳源的培养基，试验表明该菌对葡萄糖和蔗糖的利用优于麦芽糖和淀粉，且对葡萄糖的利用优于蔗糖；在麦芽糖或淀粉为碳源的 PDA 培养基上几乎不生长，且在各种 PDA 上均不如在CM 培养基上生长快。进一步观察发现，随着时间的推移，该菌的生长速度趋于缓慢，这可能与培养基中养分的减少或者自身产生的抑制物质有关。051052053054051517192123252729时 间 (d)直径(m) CMglu-PDAsc图 7. 不同培养基上菌落直径的比较 Figure7.Compr

27、asion of growth on different media4系统发育分析在 PAUP* 4.0b10 中进行最大简约法分析，所有的 685 个特征均被视为无序且权重相同，其中有 377 个恒量特征和 78 个无效的变量特征；空缺（Gap ）视为缺失（missing ）；采用启发式搜索，设置随机搜索的重复数为 500；最后用 Bootstrap 重复 1000 次评估各节点支持率。所构建的 MP 树（图 8）步长 Tree length= 701，CI= 0.5950， RI= 0.8110，RC= 0.5275。用似然法分析相同比对结果，拓扑学结构一致，主要区别是不同节点的 BP 值

28、稍有差异。系统发育学结果显示：A. take 的五个菌株与外类群 C. cynodontis 的亲缘关系较近。用Bootstarp 检验处于内群中的两个主要的谱系，其中一个支持率为 98%，是由Balansia，Epichlo 和 Neotyphodium 三个属构成的；另一个谱系的支持率较低（ 78%），由Heteroepichlo， Myriogenospora 及 Metarhizium 三个属构成。后者分别以 98%和 91%的支持率解决了两个群，较小的群是由 Metarhizium 属单独构成；较大的群内嵌套了一对姐妹群，分别由 Myriogenospora 属的两个代表种和 Het

29、eroepichlo 属及试验菌株 Epch 构成的单系群组成，支持率分别为 100%和 60%。本试验主要针对 Epch 的位置，从所构建的系统发育树中可见，Epch 位于 Heteroepichlo 属构成的单系群中，这说明它与该属的其它成员来源于同一个祖先，且它与 H. sasae 的三个菌株的亲缘关系最近，此节点支持率达到了 100%。对 Heteroepichlo 属和与其关系最近的 Myriogenospora 属进行比对分析，仍然以 C. cynodontis 为外类群作系统发育学分析，分别构建 MPT 和 MLT（图 9）。11 个种的比对结果包含了 607 个特征，均被视为无

30、序且权重相同，其中有 468 个恒量特征和 33 个无效的变量特征；空缺视为缺失；MPT 步长为 Tree length= 190 ，CI= 0.9221，RI = 0.9552， RC = 0.8949。用 modeltest3.7 建立 MLT 的 HKY85 模型，碱基频率为 A=0.22190，C=0.31180，G=0.25410， T=0.21220，分析结果 Ln likelihood = -1688.34071。MPT 与 MLT 的拓扑学结构完全一致，只是后者比前者的支持率高。MLT 中，H. sasae 的三个菌株聚类的节点支持率为 100%，而在MPT 中为 92%。尽管

31、只有这两个属构建的系统发育树，它们的拓扑结构与图 8 几乎相同，只是 BP 值有所不同。图 8. 用 MP 法构建的 Heteroepichlo 相关属的系统树Figure 8. MP tree of Heteroepichlo and related genera图 9.分别用 MP 法和 ML 法用 MP 法构建的 Heteroepichlo 相关属的系统树Figure 9. MP and ML trees of Heteroepichlo and related genera三、讨论目前，竹子香柱型丛枝病的病原包括箬竹香柱菌（Epichlo sasae）和箣竹香柱菌（Epichlo ba

32、mbusae）两种。长期以来，国内对 E. bambusae 只有简单的描述，未见深入的研究；对 E. sasae 的研究更少，只是记载了其引起了箬竹丛枝病，未见其它描述。本研究通过比较形态学特征和 rDNA-ITS 序列分析对采自安徽短穗竹丛枝病菌作了比较研究，最终确定其为E. sasae，并根据 Eiji Tanaka (2002) 年的研究结果将其更名为箬竹异香柱菌，即 Heteroepichlo sasae (Hara) E. Tanaka。形态学上，本研究病原菌与 Hino 及魏景超记录的 H. sasae 几乎一致。由于子囊孢子极易断裂，且其断裂与从子囊中释放几乎是同时的，故未能测

33、出子囊的大小，但因其与子囊均为线形，故其应该比子囊稍短。本试验中未观察到纯培养的菌落产生分生孢子，分析其原因可能有以下几点：1、培养时间太短；2、温度不合适；3、营养过于丰富。试验中发现该菌对葡萄糖利用优于其它碳源，说明该菌的最佳碳源是葡萄糖，但即使在最佳生长条件下，其菌落的生长也非常缓慢。在温度对菌落生长影响研究中本研究只涉及到 3 个梯度温度，因此今后应该对该菌的生长温度适应范围以及最适温度进行进一步研究。系统发育学上，rDNA-ITS 系统发育树显示，试验菌株在 Heteroepichlo 属构成的单系群上，且与 H.sasae 高度聚类，说明它们的亲缘关系很近，可以解释为菌株 Epch

34、 就是 H.sasae，只是因为它与 H. sasae (AB065430，AB065431 ，AB065432)三者的来源不同，故难免会有一些遗传上的差异；另一种解释就是把试验菌株看作一新种，但是这种解释没有得到充分的形态学证据，且根据 Blast 结果，菌株 Epch 与 H. sasae (AB065430，AB065431，AB065432)三者间的差异仅为 7%，故需要进一步的形态学结合分子生物学数据的支持。国内有关文献对 H. sasae 和 H. bambusae 描述比较简单，而二者之间的形态学差异不甚明显，因此有必要对我国已经报道的不同竹种上的香柱菌进行详细的形态学以及分子系

35、统学的研究以确定正确的命名。参考文献 徐金梅，赵荣军，费本华.我国竹材材性与加工利用研究新进展J.木材加工机械,2007 (3)39-42 杨淑敏，江泽慧，任海青 .竹类解剖特性研究现状及展望 J.世界竹藤通讯，2006(4)3: 1-6+12 马乃训，陈光才 ,袁金玲.国产竹类植物生物多样性及保护策略 J.林业科学，2007，43（4）：102-106 赖广辉, 傅乐意. 竹黄主要寄主植物的研究J. 中国野生植物资源 , 2000,(01),8-11 耿伯介等编辑,中国植物志9卷1分册. 北京:科学出版社.1996 :243 林泉主编,浙江植物志 7 卷. 杭州:浙江科学技术出版社.1993 :80