定量免疫实验.ppt

1、定量免疫实验,赵丽娅,一、原理,定量免疫实验的原理是基于抗原 - 抗体的反应。即抗原决定簇与抗体结合部位相结合，这种结合，这是由氢键，离子键，疏水相互作用，以及范德华力来实现的，它是一种平衡反应，符合质量相互作用定律。由于抗体抗原的结合具有特异性和专一性的特点，这种检测可以定量地检测某一特异的蛋白（抗原或抗体）。,抗原抗体反应的速度，跟温度相关，适当的增加温度，或者降低温度，可以改变抗原抗体的反应时间。,二 、应用,在医疗诊断和研究中测定生物分子的浓度，例如，激素，细胞因子，和肿瘤标志物或者小的化学分子，可用于各种疾病的 诊断、疗效评价及发病机制的研究。免疫测定法的优点是它具有很高的灵敏度。测

2、定的灵敏度ng 甚至pg水平。,三、常用方法,1、双抗体夹心法 将已知抗体结合在固相载体，加入待测的样品（抗原），再加入酶标抗体。最后再加入酶的显色底物与之反应显色。在测定时，受检标本（测定其中的抗原）与固相载体表面的抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。,2、竞争法 小分子半抗原如地高辛、茶碱等因其只有一个抗原决定簇，可采用竞争抑制

3、法测定。竞争法就是将待检抗原和标记的抗原竞争的 与固相的抗体结合，样品中抗原含量越多，结合在固相抗体上的酶标抗原就越少，显色越浅。以此便可以检测出未知抗原的量。,操作步骤1）先用特异性抗体包被固相载体并封闭。2）同时加入待测样本和酶标抗原小分子，孵育一定时间后洗板。3）加入酶底物，孵育显色测定，显色的强弱与待测样本的小分子含量成反比，,检测限度,定义：检测限为最低抗原浓度，用统计学方法计算出的，最低的测量信号是一个显著偏离0的值。方法：对应于标准曲线的零值，用10个起始抗原浓度的数值。计算它们的的算术平均值和它们的标准偏差。,选择方法的原则,每种方法都有优缺点，如何选择将取决于实验者的免疫测定

4、的要求。关键参数是所需灵敏度，合适的时间，抗原的大小，标记的能力。对于非常低的抗原浓度的标本，需要敏感性高的方法。夹心测定其理论最高敏感度为10-15 到10- 16 mol/l。竞争实验只有约10-14 mol/I。免疫测定的灵敏度，主要取决于抗体与抗原亲和力。抗原的大小和结构也很重要。使用夹心测定法中，抗原必须具备两个抗体结合位点，可以结合不同的两种抗体，小的半抗原不能用双抗体夹心法进行检测。,RIA放射免疫实验,放射免疫分析也称同位素标记技术。它是将同位素分析的高灵敏性与抗原抗体反应的特异性相结合的一种灵敏的检测方法。RIA法所用的标记标记物质是放射性核素，检测时需要特殊仪器检测放射量，

5、以对待测物质进行定性、定量分析。虽然放射免疫法，在许多领域被其他免疫测定法（ELISA法等）被替代，但它对于小分子的定量测定始终扮演一个重要的角色（如肽激素）。,放射免疫分析技术的原理为放射性标记的抗原（Ag*)和被测抗原Ag（或标准品）与有限的特异性抗体发生可逆的竞争结合反应，最终形成的放射性抗原-抗体复合物的量与被测物的含量成负相关。当被测抗原含量高时，对抗体的竞争结合能力就越强，Ag-Ab的形成量越多,Ag*-Ab的复合物就相对较少，反之，当待测抗原含量低时，对抗体的结合能力就弱，Ag*-Ab复合物的形成量就增多。,游离抗原与抗原抗体的分离,1、吸附游离的抗原活性炭、滑石粉、硅酸盐、离子

6、交换凝胶柱2、沉淀抗原抗体复合物。有机溶剂，硫酸铵，PEG3、市售的固相分离的固相载体。,放射性的检测,放射活性可用闪烁计数器测定。此装置的原理是基于放射性同位素释放的放射性能量可转换为光子，其信号能够被检测到。光强度与核衰变释放的能量成正比。常用的测量仪器：1、碘化钠晶体闪烁器。但采用晶体闪烁器的测量仪器不适合用于检测弱发射器如3H和14C。2、液体闪烁计数器。它是一种或多种有机溶剂的混合物，可确保与含水试样好混匀。一个粒子的放射性衰变后的能量就转移到溶剂分子，使它变得活跃。这些溶剂分子的能量转移到荧光团分子。能量大约为365纳米范围内的光子的形式，可以检测荧光的强度与抗原或抗体的浓度呈负相

7、关。 一些液体闪烁计数器不能检测短波，所以第二荧光团加入到混合液中。它由第一荧光团激发而发射更长波长的光，范围为约420纳米内,酶联免疫吸附实验（ELISA),1971年瑞典的Engvall等人分别以纤维素和聚苯乙烯试管作为固相载体吸附抗原/抗体，建立了酶联免疫吸附法简称(ELISA)。1974年Voller等人改用聚苯乙烯微量反应板作为固相免疫吸附载体，使ELISA法得以推广应用。由于标记酶的酶促反应的放大作用，它的灵敏度不仅接近放射免疫的检出水平，并且还避免使用放射性同位素产生的弊病。 ELISA法由于无需特殊的仪器， 检测简单，因此被广泛应用于医学临床和生物学研究上，测定各种各样的抗原、

8、半抗原和抗体，特别是在单克隆抗体研究中，为杂交瘤细胞株的筛选，提供了简便、灵敏、快速的检测方法。,ELISA是免疫酶技术的一种，其特点是利用聚苯乙烯微量反应板（或球）吸附抗原或抗体，使之固相化，免疫反应和酶促反应都能在其中进行，在每次反应后都要反复洗涤，这既保证了反应的定量关系，也减少了未反应的游离的抗体或抗原的分离步骤。,几种常用的ELISA测定方法,测定抗体的间接法,测定抗原的双抗体夹心法,测定抗原的竞争法,测定抗原抗体的间接法原理是利用酶标记的抗抗体以检测已于固相抗原结合的待检抗体，故称为间接法。首先将已知的定量抗原吸附在聚苯乙烯微量反应板的凹孔内，加待测抗体，保温后洗涤以除去未结合的杂

9、蛋白，加酶标抗抗体，保温后洗涤，加底物保温30分钟后，加酸或碱中止酶促反应，用目测或光电比色测定抗体含量。,包被,包被就是将抗体或抗原结合到固相载体上的过程。聚苯乙烯微量滴定板是比较常用的，它具有对蛋白质高结合能力，这种结合主要是基于疏水相互作用相对不依赖于pH，一般来说，抗体和抗原的稀释液采用PBS（pH7.4）碳酸钠缓冲液（pH 9.6）（表4-1）。最优的抗体和抗原浓度必须凭经验确定，根据测定的要求，但它应位于0.5一10.0g/ ml的范围内。通常在加入适量包被缓冲液后。温育过夜（1 0一1 8小时）以避免在各个洗涤步骤中的抗原 - 抗体复合物的损失，抗体或抗原可以共价偶联到微量滴定板

10、。,封闭包被时所用的抗体或抗原浓度较低，吸收后固相载体表面仍有未被占据的空隙，为了避免固相载体非特异性吸附酶标记抗体或抗原分子。因此，需要用一种不相关蛋白填充空隙，此步骤叫做封闭。常用的封闭剂有4%的脱脂奶粉，0.55的BSA（表4-1）10%的小牛血清1%的明胶。,封闭是否必要，取决于elisa的模式及具体的实验条件。并非所有的ELISA 固相均需封闭，封闭不当反而会使阴性本底增高。一般说来，双抗体夹心法，只要酶标记物是高活性的，操作时洗涤彻底，不经封闭也可得到满意的结果。但在间接法测定中，封闭一般是不可少的,洗涤 各步骤的洗涤对于获取好的标准曲线，取得满意的实验结果是至关重要的。对于洗涤步

11、骤，可以用PBS，生理盐水，PBS液，或者用简单的自来水。提示：洗涤时添加非离子型去污剂，如吐温20，Nonidet洗涤剂P-40和Triton X-100中的0.010.1的温育与标记抗体或抗原中的浓度也降低了非特异性吸附。而且在该浓度范围内抗原抗体的特异性结合的也不被干扰。,酶和底物,被用作标记的酶，必须适应多种要求1、高酶活性是一个重要的条件。2、该酶应该能在4- 37的范围内稳定一段较长时间，并应容易与抗体或抗原耦合。酶辣根过氧化物酶（HRP），从小牛肠碱性磷酸酶（AP），半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶。酶的活性是通过比色法，荧光法等技术检测来确定。比色法是最基础最常用的，由于以下优点：（1

12、）有色终产物在反应停止后保持稳定很长一段时间; （2）在筛选程序中，微量滴定板的成色反应可被非常快的目测到; （3）反应结果的测量可以快速用相对廉价的分光光度计进行。,常见的酶及其底物辣根过氧化物酶（HRP)，常用的供氢体是TMB，TMB氧化后呈蓝色，最适的吸收波长为405nm。常用的反应终止液为硫酸，浓度一般采用2mol/l。碱性磷酸酯酶（AP),在ELISA中，AP系统的敏感度一般高于HRP系统，空白值也较低，但AP价格昂贵。采用的对硝基苯磷酸酯作为底物，显色反应后呈黄色，反应终止液为NaOH,浓度一般采用2mol/l。,HRP和AP均有荧光底物，可以取代显色反应而进行荧光检测，荧光检测的

13、灵敏度高于显色反应，但是显色反应所需药品较便宜，所以一般显色反应较常用。,Table 4-2: Enzymes and substrates for the ELlSA.,实践,人表皮生长因子ELISA试剂盒,Thank you!,Add your title,请在此添加段落内容,请在此添加段落内容,Content,welcome to use these PowerPoint templates, New Content design, 10 years experience,请在此添加段落内容请在此添加段落内容,Content,welcome to use these PowerPoint

14、 templates, New Content design, 10 years experience,请在此添加段落内容请在此添加段落内容,Content,welcome to use these PowerPoint templates, New Content design, 10 years experience,请在此添加段落内容请在此添加段落内容,Content,welcome to use these PowerPoint templates, New Content design, 10 years experience,请在此添加段落内容请在此添加段落内容,请在此添加段落内容,请在此添加段落内容请在此添加段落内容,Add your title,请在此添加段落内容, 请在此添加段落内容,Content,请在此添加段落内容请在此添加段落内容,请在此添加段落内容请在此添加段落内容,请在此添加段落内容,请在此添加段落内容,请在此添加段落内容,请在此添加段落内容,请在此添加段落内容,请在此添加段落内容,Content,2,3,1,请在此添加段落内容,请在此添加段落内容请在此添加段落内容,请在此添加段落内容,Content,Content,请在此添加段落内容,请在此添加段落内容,请在此添加段落内容,请在此添加段落内容,