海洋放线菌S1001中抗肿瘤活性成分的研究.doc

1、海洋放线菌 S1001 中抗肿瘤活性成分的研究作者：刘睿 朱天骄 朱伟明 李冬 崔承彬，顾谦群 【关键词】 海洋放线菌；,次级代谢产物；,异黄酮；,环二肽；,抗肿瘤活性摘要： 一株来源于海泥的放线菌 S1001 发酵产物具有致细胞坏死活性，本文采用溶剂萃取、硅胶柱层析及制备 HPLC 等分离手段对该菌株发酵产物的活性部位进行了活性追踪分离，共分离得到 8 个化合物，通过理化性质及波谱学手段，鉴定其结构分别为 4，5，7 三羟基异黄酮(1)，4(2，4 二羟基苯酰胺基)苯甲酸(2)，环(甘氨酸丙氨酸)(3)，环(甘氨酸脯氨酸)(4)，环(亮氨酸酪氨酸)(5)，环(缬氨酸亮氨酸)(6)，环(缬氨酸

2、异亮氨酸)(7)，环(苯丙氨酸甘氨酸)(8)。并用 SRB 法初步评价了化合物 18 的抗肿瘤活性，结果表明化合物 4、5 和 7 在 10mol/L 浓度时对 K562 细胞表现出了一定的抑制活性。关键词： 海洋放线菌； 次级代谢产物； 异黄酮； 环二肽； 抗肿瘤活性The antitumor active component from marine derived actinomycete S1001KEY WORDS Marine actinomycete; Secondary metabolites; Isoflavone; Cyclodipeptides; Antitumor act

3、ivity海洋微生物由于生活在高盐、高压及寡营养的特殊环境中，具有独特的代谢方式，因此能产生许多结构新颖、活性独特的次级代谢产物。近 20 年来，有关海洋微生物产生新的活性次级代谢产物的报道逐渐增多，海洋微生物作为活性物质的新来源正日益被国内外海洋研究工作者重视。本实验室以小鼠乳腺癌 tsFT210 细胞为活性筛选模型，对我国青岛沿海采集的海泥样品中分离纯化的微生物菌株进行筛选1 ，得到一株放线菌 S1001 具有坏死性细胞毒作用。为阐明它的抗肿瘤活性成分，采用活性追踪的方法，对其发酵物进行研究，迄今为止，共分离得到 9 个化合物，利用理化性质和波谱学方法鉴定了其中 8 个化合物。本文着重报道

4、化合物 18 的提取分离，结构鉴定及活性研究。1 材料与方法1.1 试验试剂和仪器熔点用日本 Yanaco 公司 MP500D 型显微熔点仪测定(未校正)；质谱用 QTOF ULTIMA GLOBAL GAA076 LC 型质谱仪，核磁共振谱用日本 JEOL JNMECP600 型核磁共振仪测定；制备用高效液相色谱仪采用日本岛津公司产品LC6AD 泵，SPDM20AVP 检测器，SCL10AV 型系统控制器，Shinpak C18 柱(20mm250mm，5m)，4ml/min ；Sephadex LH20 和层析用硅胶 H(1040m)分别为 Pharmacia 公司和青岛海洋化工厂产品；活

5、性测试采用小鼠温敏型乳腺癌 tsFT210 细胞；胎牛血清(FBS)和 RPMI1640 细胞培养基分别为 Hyclone 公司(Cat.No.STF721)和 GIBCOBRL 公司产品。磺酰罗丹明 B(SRB)为 Sigma 公司产品。1.2 菌株的分离与培养1.2.1 产生菌株 放线菌 S1001 从青岛沿海的海泥中分离得到，其发酵液的总提物对小鼠乳腺癌 tsFT210 细胞表现出坏死性细胞毒活性。1.2.2 培养 从 28培养 4d 的高氏 1 号培养基上取适量菌体，接种于种子培养基(葡萄糖 2%，可溶性淀粉 1%，豆粉 0.5%，蛋白胨 2%，酵母提取物 0.4%，牛肉膏 0.1%，

6、K2HPO4 0.05%，CaCO3 0.2%，陈海水配制，pH 值调至 7.0)，于 28，120r/min 的条件下摇床培养 2d 得到种子培养液。将该种子培养液按 10%的接种量，接种于 150 瓶每瓶含 100ml 液体培养基(成分同上)的 500ml 三角瓶中，28，120r/min 摇床培养 5d，发酵15L。1.3 活性测试1.3.1 生物活性测试方法 按照文献2，3采用SRB(sulforhodamine B，磺酰罗丹明 B)法，结合显微镜观察细胞形态变化(顺铂做阳性对照)。1.3.2 有效部位的确定 取发酵液 1ml，减压浓缩蒸干，然后溶于甲醇，该甲醇提取物在 1mg/ml

7、的浓度下，显示了强的坏死性细胞毒抗肿瘤活性。将甲醇提取物配制成 10mg/ml 的蒸馏水混悬液，取混悬液三份分别加入等体积的乙酸乙酯和正丁醇萃取并测试活性。结果表明，只有乙酸乙酯萃取物具有与粗提物相应的生物活性，故确定为有效部位。1.4 提取分离培养物用滤纸抽滤，分为上清液和菌丝体两部分。上清液 15L浓缩至约 5L，等体积乙酸乙酯萃取三次；菌丝体先用 80%丙酮提取，提取液浓缩至无丙酮后所得的水相再用等体积乙酸乙酸萃取三次，合并两部分的乙酸乙酯萃取物得总浸膏 2.6g。浸膏拌硅胶过柱，以石油醚丙酮、氯仿甲醇梯度洗脱，收集各馏分，减压浓缩、合并，得到 9 个色谱组份 Fr1Fr6。每个组分经活

8、性测试，确定 Fr3、Fr4 和 Fr6 为活性组分。经反复的正反相硅胶、Sephadex LH20 柱色谱和高效制备液相色谱等分离手段，从 Fr3 得到化合物 2(4mg)、6(11mg)，从 Fr4 得化合物 1(5mg)、5(13mg)、7(9mg)，从 Fr6 得化合物 3(28mg)、4(18mg)、8(10mg)。2 结果与讨论2.1 化合物结构鉴定化合物 1 无色针晶，ESIMS(Negative)：m/z 269MH-。1HNMR(600MHz，CD3OD)：8.04(1H，s，H2)，735(2H，d，J=86Hz，H2，6)，682(2H，d，J=86Hz，H3，5)，63

9、2(1H，d，J=22Hz，H8)，620(1H，d，J=22Hz，H6)；13CNMR(150MHz，CD3OD)：1822(s，C4)，1659(s，C7)，1638(s，C5)，1597(s，C9)，1588(s，C4)，1548(d，C2)，1313(d，C2，6)，1247(s，C1)，1233(s，C3)，1162(d，C3，5)，1062(s，C10)，1001(d，C6)，947(d，C8)，参照文献4确定结构为 4，5，7 三羟基异黄酮(4，5，7trihydroxyisoflavone)。化合物 2 无色针晶，ESIMS(Positive)：m/z 274 M+H+。1HN

10、MR(600MHz，C6D5Nd5)：805(1H，d，J=86Hz，H6)，736(2H，dt，J=66，22Hz，H2，6)，693(1H，dd，J=86，22Hz，H5)，685(1H，d，J=22Hz，H3)，684(2H，dt，J=66，22Hz，H3，5)，结构鉴定为 4(2，4 二羟基苯甲酰胺基)苯甲酸5 4(2，4dihydroxybenzamido)benzoic acid 。化合物 3 白色粉末，1HNMR(600MHz，CD3OD)：400(1H，brq，J=69Hz，H6)，391(2H，dd，J=47，11Hz，H3)，142(3H，d，J=69Hz，CH37)；13

11、CNMR(150MHz，CD3OD)：1716(s，C1)，1687(s，C4)，517(d，C6)，454(t，C3)，194(q，C7)，参照文献6确定结构为环(甘氨酸丙氨酸)cyclo(GlyAla) 。化合物 4 无色片状结晶，1HNMR(600MHz，CD3OD)：423(1H，brt， J=82Hz， H9)， 409(1H，d，J=179Hz，H3a)，372(1H，d，J=179Hz，H3b)，348357(2H，m，H6)，229233(1H，m，H8a)，200204(1H，m，H8b)，190198(2H，m，H7)，确定结构为环(甘氨酸脯氨酸)cyclo(GlyPro)

12、 。化合物 5 无色针晶，1HNMR(600MHz，DMSOd6)：690(2H，d，J=84Hz，H2，6)，664(2H，d，J=84Hz，H3，5)，406(1H，m，H3)，344(1H，m，H6)，301(1H，dd，J=136，32Hz，H11a)，269(1H，dd，J=136，48Hz，H11b)，142(1H，m，H8)，075(1H，m，H7a)，012(1H，m，H7b)，064(3H，d，J=66Hz，CH39)，064(3H，d，J=66Hz，CH310)；13CNMR(150MHz，DMSOd6)：1674(s，C4)，1662(s，C1)，1564(s，C4)，1

13、312(d，C2，6)，1259(s，C1)，1149(d，C3，5)，557(d，C6)，522(d，C3)，437(t，C11)，377(t，C7)，229(s，C8)，228(q，C9)，213(q，C10)，参照文献7确定结构为环(亮氨酸酪氨酸)cyclo(LeuTyr) 。化合物 6 无色针晶，1HNMR(600MHz，CD3OD)：397(1H，brt，J=68Hz，H6)，381(1H，d，J=37Hz，H3)，230(1H，m，H11)，184(1H，m，H8)，166175(2H，m，H7)，104(3H，d，J=73Hz，CH312)，094(9H，d，J=66Hz，CH3

14、9，10，13)；13CNMR(150MHz，CD3OD)：1716(s，C1)，1702(s，C4)，612(d，C3)，542(d，C6)，431(t，C7)，336(d，C11)，252(d，C8)，233(q，C9)，225(q，C10)，188(q，C12)，169(q，C13)，结合文献8确定结构为环(缬氨酸亮氨酸)cyclo(ValLeu) 。化合物 7 无色针晶，1HNMR(600MHz，CD3OD)：393(1H，dd，J=94，47Hz，H6)，376(1H，dd，J=40，13Hz，H3)，221(1H，m，H11)，185(1H，m，H7)，173(1H，m，H8a)，

15、159(1H，m，H8b)，104(3H，d，J=73Hz，CH310)，096(3H，d，J=60Hz，CH312)，095(3H，d，J=44Hz，CH39)，094(3H，d，J=60Hz，CH313)，结合文献7确定为环(缬氨酸异亮氨酸)cyclo(ValIle) 。化合物 8 无色针晶，1HNMR(600MHz，DMSOd)：725729(3H，m，H2，4，6)，717(1H，d，J=80Hz，H3，5)，406(1H，dd，J=73，47Hz，H6)，334(1H，dd，J=172，29Hz，H3a)，309(1H，dd，J=132，47Hz，H7a)，287(1H，dd，J=1

16、32，47Hz，H7b)，274(1H，d，J=172Hz，H3b)，结合文献8并与实验室已有样品对照确定结构为环(苯丙氨酸甘氨酸)cyclo(PheGly)(Fig.1)。2.2 抗肿瘤活性采用 SRB 法并结合显微镜检测细胞形态学变化，测定了化合物 18 对人慢性髓原白血病细胞 K562 肿瘤细胞的抑制活性，结果表明环二肽类化合物 4、5 和 7 在 10mol/L 时即能观查到细胞坏死活性，抑制率分别为 15.4%、19.3%和 18.6%，其他化合物在 100mol/L高浓度时也未检测到相关活性。3 讨论本文采用活性追踪的方法从一株海洋放线菌 S1001 的活性部位分离鉴定了 1 个异

17、黄酮类化合物，1 个苯甲酸类衍生物，以及 6 个环二肽类化合物，并经活性测试阐明了环二肽类化合物为该菌株的主要活性相关成分。文献报道也显示环二肽类化合物可作为免疫功能调节剂和抗肿瘤制剂，并且体内体外试验证明均有效9，10 ，值得进一步研究。菌株S1001 的次级代谢产物比较单一，主要为环二肽类化合物且产量较大，因此可以考虑作为环二肽的生产菌株加以利用。参考文献1 Zhu T J, Cui C B, Gu Q Q, et al. Isolation of microorganisms from marine samples and screening of their antitumor act

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