核因子κB与腹部开放伤合并海水浸泡大鼠全身炎症反应综合征的关系.doc

1、核因子B 与腹部开放伤合并海水浸泡大鼠全身炎症反应综合征的关系作者：王育红 刘刚 虞积耀 孟宇宏 张夕凉 周丽君 王大鹏 【摘要】 目的 探讨腹部开放伤合并海水浸泡大鼠全身炎症反应综合征（SIRS）发生时核因子B(NFB) 的活性与 SIRS 的关系。方法 采用腹部开放伤合并海水浸泡大鼠致伤模型并诱发 SIRS。酶联免疫吸附（ELISA）法检测血肿瘤坏死因子 （TNF ） 、白细胞介素6 （IL6 ）水平，免疫组化技术检测 NFB 在外周血淋巴细胞（PBL）和小肠组织中的活性。结果 腹部开放伤后海水浸泡 1 小时，大鼠出现 SIRS；血 TNF 、IL6 水平升高；免疫组化显示大鼠 PBL 和

2、小肠组织中 NFB 表达的阳性率显著升高，与对照组比较有统计学意义(P0.05 或 P0.01)。结论 腹部开放伤合并海水浸泡可致大鼠SIRS，NFB 和细胞因子参与了 SIRS 的发生、发展。NFB 的激活介导了 TNF 、IL6 等细胞因子的释放，在 SIRS 中可能处于中心环节。 【关键词】 腹部损伤 海水浸泡 核因子B 全身炎症反应综合征肠道在多器官功能障碍综合征（MODS）发生发展过程中具有重要作用1-3 ，肠黏膜屏障功能受损所引起的细菌易位和内毒素血症已成为全身炎症反应综合征(SIRS)的重要诱因，进而启动 MODS 并危及生命。海水浸泡伤具有以下特点：血液出现高钠、高氯、高渗状态

3、，以及严重的水、电解质紊乱，伴有代谢性及呼吸性酸中毒4，5 。核因子B(nuclear factor kappaB，NFB) 是一种普遍存在的快反应转录因子。NFB 激活后，可启动和调控一系列参与炎症反应的细胞因子基因的表达。本研究拟从大鼠腹部开放伤海水浸泡模型中，观察NFB 的活化与肿瘤坏死因子 （TNF ） 、白介素6 （IL6 ）的变化，探讨大鼠腹腔海水浸泡损伤中 SIRS 的作用机制。材料与方法1 动物模型及分组健康雄性 Wistar 大鼠 50 只，体重（23020）g，清洁级，随机分为 5 组，每组 10 只。A 组：腹部开放伤合并海水浸泡组；B 组：单纯腹部开放伤组；C 组：单纯

4、海水浸泡组；D 组：腹部开放伤合并生理盐水浸泡组；E 组：正常对照组。大鼠腹腔麻醉成功后取仰卧位，沿中下腹部正中切开约 3cm 进腹，用自制硬质铁网片撑开并固定以防止内脏的脱出，造成人为的腹部开放性伤；将大鼠直立浸泡于 22海水浴中 1 小时。人工海水根据国家海洋局第三研究所提供的我国东南沿海海水配方配置。2 观察指标和方法2.1 观察各组大鼠直肠温度，心率，呼吸及外周血白细胞计数。2.2 肠黏膜组织取材：在距回盲部 5cm 处取 2cm 长的小肠组织，常规固定、脱水，垂直定向石蜡包埋，垂直切片，动物标本均连续切片20 张，切片厚度为 4m，留作光镜及免疫组化实验用。2.3 肠黏膜上皮 NFB

5、 检测：抗 NFB/p65 单克隆抗体购自Thermo Scientific 公司，工作浓度 1：100。正常胎盘组织作为阳性对照。采用 Envision 两步法进行（按说明书操作） 。结果判定：细胞核上呈现棕黄色为阳性，未见着色细胞者为阴性。每一玻片任选 5 个高倍视野（400） ，计算阳性细胞百分率（阳性细胞数/计数细胞总数100） 。2.4 血淋巴细胞涂片制备 使用密度梯度离心法，用细胞离心甩片机 （英国 Shandon 公司）将细胞离心至玻片，形成直径 1cm 的细胞膜，固定于 40g/L 的多聚甲醛。 血淋巴细胞免疫组化操作与组织切片大体相同。2.5 血 TNF 、IL6 水平的测定

6、：夹心法固相酶联免疫吸附分析法（ELISA）测定。操作步骤按照试剂盒说明书进行(试剂盒购自Biosource 公司).3 统计学分析实验数据用均数标准差（s）表示，数据采用 SPSS 12.0 统计软件进行方差分析和 q 检验。某些观察指标间的相关性用 Pearson 相关分析。P0.05 表示差异有统计学意义。结果1 SIRS 模型观察目前尚缺乏动物 SIRS 的诊断标准。按文献标准6,在人类 SIRS临床诊断依据的基础上，提出以下动物 SIRS 的诊断依据：（1）直肠温度较正常或伤前升高或降低 1；（2）呼吸频率超过对照值 2 倍或PaCO2 较对照值降低 25%；（3）白细胞总数超过对照

7、值的 2 倍或减少50%；（4）心率较对照值增加 50%。上述几项中，采用直肠温度、PaCO2、白细胞计数和分类的变化进行诊断相对较为准确。动物发生 SIRS时，心排血量减少，外周阻力增加，氧耗量和氧摄取增加，血浆急性期蛋白和多种炎性介质(如肿瘤坏死因子、白细胞介素和磷脂酶 A2 等)水平升高；多脏器组织呈炎症改变。各组大鼠致伤 1 小时后观察直肠温度、心率、呼吸、外周血白细胞计数。腹腔海水浸泡组大鼠不同程度出现直肠温度下降，心率增快，呼吸频率降低，外周血白细胞数量减少，达到动物 SIRS 的诊断标准。2 大鼠血细胞因子的变化腹部开放伤合并海水浸泡后大鼠血 TNF 和 IL6 浓度较对照组显著

8、升高(P0.01)，B 组血 TNF 浓度较 E 组显著升高(P0.01)；而与 B 组比较，C、D 组无显著差异(P0.05)，A 组血 TNF 浓度有明显差异(P0.01)。B、D 组血 IL6 浓度较 E 组升高(P0.05)；C 组血 IL6 浓度较 E 组无显著差异(P0.05);而与 B 组比较，C 组血浆 IL6 浓度升高(P0.05)，D 组无显著差异(P0.05)。结果见表1。3 大鼠外周血淋巴细胞和肠黏膜组织 NFB 活性的变化腹部开放伤合并海水浸泡后大鼠外周血淋巴细胞和肠黏膜 NFB阳性率较 E 组显著升高(P0.01)，B、D 组较 E 组显著升高(P0.01)；而与

9、B 组比较，D 组无显著差异(P0.05)。C、E 组有显著差异(P0.01)。C、E 组之间无显著差异(P0.05)。E、C 组均明显低于A、B、D 组(P0.01)，D 组显著低于 A 组(P0.01)。结果见表 1。4 肠黏膜 NFB 与血 TNF 、IL6 的相关性腹腔海水浸泡伤组大鼠肠黏膜组织中 NFB 的活性与血 TNF水平呈明显正相关 （r=0.703，P0.01 ） 。腹腔海水浸泡伤组大鼠肠黏膜组织中 NFB 的活性与血 IL6 水平呈明显正相关（r=0.738，P0.01 ） 。表 1 海水浸泡合并腹部开放伤大鼠某些指标的变化（略）与 E 组比较：aP0.01，bP0.05，

10、cP0.05；与 B 组比较：dP0.01，eP0.05，fP0.05讨论随着创伤及危重医学的发展，人们逐渐认识到肠道不仅仅是消化和吸收器官，还是阻止肠腔内细菌、毒素等有害物质侵入体内的重要屏障。肠道黏膜是创伤的易损靶器官，肠道是创伤后全身炎性反应的始动器官，产生 SIRS，还可能对其他脏器造成继发性损伤，甚至发生 MODS。NFB 是多种炎症介质的上游信号分子，其激活后可促进多种炎症介质的产生，处于调节炎症反应的中心环节。细胞处于静息状态时，NFB 以非活性形式存在于胞浆中，由 P50P65 异二聚体和 NFB抑制蛋白（IB）组成。胞外刺激通过一个或多个信号途径使 NFB三聚体复合物中的 I

11、B 磷酸化而解离，游离的 IB 与蛋白结合发生泛素化，最后经蛋白酶小体降解，NFB 二聚体从胞浆中移位至胞核内，与靶基因结合，从而启动某些基因的转录。内毒素、缺血 再灌注损伤(I/R)、氧自由基(ROS)以及严重创伤等因素使 NFB 激活，进入核内，调控众多细胞因子的基因表达，尤其是 TNF 、IL1 等原发性细胞因子的增加，进一步作用于巨噬细胞等产生大量的继发性细胞因子，如IL6 、IL8 等。有些细胞因子又进一步激活 NFB( 其中TNF 、IL1 通过受体介导途径激活 NFB) 形成正反馈的级联放大效应。NFB 通过影响炎症介质的基因转录而对炎症介质网络产生广泛作用。TNF 是 NFB

12、介导表达的重要的促炎细胞因子，在炎症反应中是激活细胞因子级联反应的主要因子，在循环中较早出现并迅速达到高峰，TNF 还可以诱导中性粒细胞的激活，促进淋巴细胞与内皮的相互黏附，刺激趋化因子分泌，导致中性粒细胞在组织中聚集。TNF 反过来又可以激活 NFB ，使细胞因子大量过度释放，引起 SIRS 或 MODS 。临床研究证实，感染所致的 SIRS 与 TNF 密切相关7，8 。我们研究发现，腹部开放伤合并海水浸泡后大鼠血 TNF 浓度 A 组较对照组显著升高(P0.01)，B 组血 TNF 浓度较 E 组升高(P0.01)；而与 B 组比较，C、D 组无显著差异(P0.05)，A 组血 TNF

13、浓度有明显差异(P0.01)。而且，A 组大鼠 PBL 中 NFB 的活性与血TNF 水平呈明显正相关。 IL6 是一种迟发性细胞因子，在感染性休克时血清 IL6 水平升高比 TNF 延迟9 。IL6 是急性相蛋白反应的主要诱导者，催化和放大炎性反应和毒性作用，造成组织细胞的损害，虽无疾病的特异性，但能直接反映各种类型损害的严重程度。有证据显示，血清中 IL6 水平可以作为细胞因子级联反应激活的一个标志，反映出宿主炎症反应与疾病严重程度间的关系，并且在脓毒症中可以作为判断预后的一个指标10 。本研究显示，A 组大鼠血 IL6 浓度较对照组显著升高(P0.01)，B、D 组血 IL6 浓度较 E

14、 组升高(P0.05)；C 组血IL6 浓度较 E 组无显著差异(P0.05);而与 B 组比较，C 组血 IL6浓度升高(P0.05)，D 组无显著差异(P0.05)。同时小肠组织病理观察也发现小肠充血、淋巴细胞浸润及肠上皮细胞间紧密连接破坏等改变。在本实验中，我们采用腹部开放海水浸泡伤大鼠致伤模型。海水浸泡 1 小时后大鼠出现 SIRS，同时提示 NFB 在海水浸泡 1 小时后其活性显著升高，进一步研究发现，NFB 活性改变与 TNF 、IL6 浓度变化基本一致，从而提示 NFB 可能在大鼠海水浸泡伤炎症发生中起关键性作用。【参考文献】1董军,张淑文,王宝恩.肠功能障碍与多器官功能障碍综合

15、征J.中国危重病急救医学,2005,17(12):764-767.2Deitch EA,Xu D,Kaise VL,et al.Role of the gut in the development of injury and shock induced SIRS and MODS: the gutlymph hypothesis a reviewJ.Front Biosci,2006,11(1):520-528.3Li JY,Lu Y,Hu S,et al.Preventive effect of glutamine on intestinal barrier dysfunction indu

16、ced by severe traumaJ.World J Gastroenterol,2002,8(1):168-171.4王育红,鹿尔驯,虞积耀,等.海水浸泡腹部开放性损伤对大鼠体液代谢的影响J.第二军医大学学报，2000,21(8):786-788.5王育红，虞积耀，段蕴铀，等.犬腹部开放伤合并人工海水浸泡后重要器官的病理变化J.创伤外科杂志，2004，6（1）：34-37.6胡森,盛志勇,周宝桐.MODS 动物模型研究进展J.中国危重病急救医学,1999,11(8):504-507.7Gando S,Kameue T,Nanzaki S,et al.Cytokines,soluble

17、thrombomodulin and disseminated intravascular coagulation in patients with systemic inflammatory response syndromeJ.Thromb Res,1995,80(6):519-526.8Bone RC.Toward a theory regarding the pathogenesis of the systemic inflammatory response syndrome: what we do and do not know about cytokine regulationJ.Crit Care Med,1996,24(2):163-173.9肖莉,王志强.细胞因子对感染性休克作用的新进展J.国外医学生理病理科学与临床分册，2003,23(1):100-102.