抗体的表达原理.ppt

1、第七章 抗体的表达,华南农业大学食品学院廖振林,提要,基因工程抗体巴在多种体系获得成功表达，包括哺乳动物细胞、大肠杆茵、酵母细胞、昆虫细胞、转基因植物以及转基出动物等表达体系。其中哺乳动物细胞最接近抗体产生的天然宿主，是比较成熟、应用最多的表达体系，主要用于表达完整抗体分子，目前治疗性单抗的生产基本都用这一表达体系。通过对友达载体、宿主细胞及各环节的改良和完善，己可达到100mgL左右的表达水平，大肠杆菌体系不能对表达产物进行糖基化，只能表达抗体分子片段，但由于其遗传背景清楚，操作简单，成本低，周期短等优点，亦有较广泛的应用，尤其在研究领域。,酵母细胞和昆虫细胞表达体系具有一定的糖基化功能，能

2、表达完整抗体分子，可达到较高表达量 ，其操作及成本较哺乳动物细脑有一定优势，但在抗体表达中的应用尚不多，应用价值有待评价。转基因植物和转基因动物表达体系主要用于工程抗体的大规模生产，其成功应用尚需时日。,抗体载体体统的种类,1 哺乳动物表达载体系统2 大肠杆菌表达系统3 酵母及昆虫细胞表达系统4 动植物表达系统,第一节 哺乳动物细胞表达系统,哺乳动物细胞是最早用来表达抗体分子的，也是目前应用最多的表达体系。哺乳动物细胞内有抗体折叠形成正确立体空间构象所必需的分子伴侣，其内质网为抗体分子的正确折叠和链内及链间二硫键的形成提供了有利的氧化-还原环境。,此外哺乳类动物细胞还拥有完整的转录、翻译后加工

3、及分泌等机制，包括抗体的糖基化、羧基化等一系列复杂的加工过程，因而哺乳动物细胞表达系统表达的抗体通常具有正确的折叠和空间构象以及正确的装配，具有良好生物活性，基本近似于天然抗体。,同时哺乳动物细胞还能实现抗体的分泌性表达，表达产物可分泌至无血清或无蛋白的培养上清中，为抗体的分离纯化提供了最大的便利。此外表达抗体的哺乳动物细胞也能进行规模化培养，为抗体的产业化相应用奠定了基础。,哺乳动物表达细胞,但哺乳动物细胞表达体系存在构建周期长、操作烦琐，表达产量相对低，生产成本较高等缺点。因此、尽管哺乳功物细胞表达体系能用于各种基因工程抗体的表达但最适合表达的还是全分子抗体以及某些不适宜在非哺乳动物细胞表

4、达的小分子抗体。哺乳动物细胞表达体系包括宿主细胞和表达载体：目前常用的宿主细胞主要有两类，一类是淋巴类细胞，另一类是非淋巴类细胞。,一、淋巴类细胞,在体内抗体是由浆细胞分泌产生的，浆细胞具有抗体正确折叠，空间构象形成，链内及链间二硫键形成的内环境，包括内质网及参与此过程的各种协向因子和分子伴侣(加重链结合蛋白BiP GRP78，二硫化异构酶等等)，而且还合完成抗体恒定区糖基化等翻译后加工修饰的细胞器、蛋白及代谢产物；因此浆细胞应是最适合表达重组抗体的。但浆细胞不能在体外长期培养，永生化或恶性转化的浆细胞瘤和骨髓瘤细胞系对于表达重组抗体是最接近浆细胞的，这些细胞同浆细胞一样能提供抗体表达所需的全

5、套协同因子、分子伴侣以及糖基化等加工机制。,因此能用于表达各种重组的基因工程抗体。但是有的骨髓瘤细胞系本身也产生免疫球蛋白链，大多为轻链，选择时应首先考虑用那些本身不产生免疫球蛋白肽链的骨髓瘤细胞系。 由于目前尚无稳定但自身不分泌Ig的人骨髓瘤细胞系，因此，用于表达基因工程抗体的淋巴类细胞，主要是小鼠和大鼠的骨髓瘤细胞。,目前在表达基因工程抗体最多的骨髓瘤细胞是小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0和NSO，以及大鼠的骨髓瘤细胞YB2/0。这些骨髓瘤细胞均不产生和分泌任何免疫球蛋白。 SP2/0细胞系是小鼠骨髓细胞p3x63Ag8与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾淋巴细胞融合而成的杂交瘤，再经培养和药物筛选发生变

6、异后获得的细胞系。 SP2/0是在表达基因工程抗体中用得最广泛的淋巴类细胞，尤其在人鼠嵌合抗体的表达中用得最多，仅其表达产量通常较低，多用于实验研究。,NSO细胞系是能在胞内合成轻链的NS1细胞的变异株，不再产生任何免疫球蛋白链，能用于表达各种全分子抗体，用该细胞系表达的抗人EGF受体的人源化改型抗体己在三期临床试用中。此外，也有用小鼠骨髓瘤P3UI细胞表达人鼠嵌合抗体。用于表达重组抗体的大鼠骨髓瘤细胞仅见有YB2/0细胞的报道，该细胞系是大鼠骨髓瘤细胞Y3与A0株大鼠脾细胞融合建立的，本身也不表达任何免疫球蛋白肽链。用骨髓瘤表达重组抗体时，所用的表达载体通常多选用免疫球蛋白的启动子和增强子，

7、因这些细胞中含有它们所需要的转录因子，有利抗体的高表达。,二、非淋巴类细胞,多种非淋巴类细胞都已被用于表达重组抗体，其中包括中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)细胞、猴肾来源的COS细胞、神经胶质瘤细胞、嗜伤细胞、Hela细胞、BHK细胞等等这些不同组织来源的不同类型的细胞，在蛋白质的糖基化中可能会有所差别，但到目前为止，尚未发现从这些非淋巴类细胞中表达的重组抗体有功能性的缺陷。非淋巴类细胞在表达重组抗体时若使用免疫球蛋自自身的转录调控元件，如启动子、增强子等，其表达效率低、出此常采用其他较强的启动子，如SV40早期基因和晚期基因启动子(Psv40-EL),CHO

8、,人巨细胞病毒立早基因启动子(PhCMV- IE)，病毒长末端重复序列LTR等等。通常非淋巴细胞表达重组抗体的产量低于淋巴类细胞，大多数在lugml以下。但近十余年的研究表明，通过一系列现代分子生物学技术，尤其是高效扩增表达技术，可使重组抗体在CHO细胞中的表达产量达200ug/ml。,此外，CHO细胞遗传背景清楚；转染效率高；能适用于多种载体；能表达各种类型的重组抗体；可长期稳定传代并稳定表达有功能活性抗体；可用无血清或无蛋白培养基培养，有利于抗体的纯化；能进行大规模培养。因而CHO细胞已成为生物技术产业化培养的首选工程细胞系， 目前已批准上市的基因工程抗体几乎都是在CHO细胞中表达的。,C

9、OS,另一种常用于表达重组抗体的非淋巴类细胞是COS细胞，COS细胞是用sv40病毒的大T抗原转染猴肾细胞获得的一株能长期传代的细胞系，含有SV40复制子的重组表达质粒转染COS细胞后，其重组DNA并不整合到细胞的染色体上、而是以游离的形式存在于细胞浆内、并迅速大量复制达到很高的拷贝数； COS细胞也具有糖基化和装P配分泌抗体的功能。,因此表达的各种抗体具有抗体的功能活性：由于转染的外源DNA在COS细胞并不整合，而是以游离形式存在并复制，因此COS细胞最常用于抗体的瞬时表达。近年来COS细胞己用于筛选或检测新构建的新型抗体的活性及特征，也用于研究从噬菌体库中筛选的抗体基因在真核细胞中表达的功

10、能和特点，还用于各种抗体突变体的筛选。而且，结构更为复杂的双特异性抗体也在COS细胞表达成功。 如抗人OKT3/转铁蛋白受体的双特异抗体在COS细胞成功表达，其产量和活性均优于在大肠杆菌中的表达。,三、抗体的高效表达,治疗用基因工程抗体的临床用药量大，还远超过其它生物制品。以美国批准上市的治疗肿瘤的两种人源化抗体Rituxan和Herceptin为例 ， Rituxan 一个疗程约需用药1.2g， Herceptin一个疗程约需用药0.88g，而正在临床试用的抗VEGF人源化抗体，一个病人的最大用药量甚至达到了7.8g，这些抗体类生物制品比细胞因子类生物制品用药量高出几万倍。因而基因工程抗体的

11、高效表达已经成为其临床应用的最重要的先决条件之一，甚至已影响到基因工程抗体的研究开发。目前已上市的以及正处于临床试用中的基因工程抗体多达上百种，其中绝大多数那是在哺乳动物细胞中表达的，更确切地说，是在CHO细胞中表达的。以下将简要地叙述抗体在哺乳动物细胞高效表达所涉及的诸多要素(见表7-1)。,抗体表达的策略,抗体在哺乳动物细胞中表达的过程是抗体的重组表达载体与宿主细胞之间相互作用的一个复杂过程，包括5个相对独立的环节：抗体基因在宿主细胞染色体上的定位，主要是指抗体基因在染色体上的整合位点以及抗体基因的基因剂量。抗体mRNA的转录，转录效率与mRNA的稳定性是其中最重要的因素。抗体基因的翻译。

12、抗体的翻译后加工、组装。抗体的分泌；针对以上5个环节，设计相应的措施提高各环节的效率，有助于提高基因工程抗体在哺乳动物细胞中的表达水平。此外还有一些实际操作因素的影响，如高表达细胞株的筛选，生产细胞的稳定等等。,（一）哺乳动物细胞表达抗体的载体系统,基因工程抗体的表达载体系统是获得高表达抗体细胞株的关键，在确定宿主细胞后，基因工程抗体的表达产量很大程度上由共表达载体的各表达调控元件及组织方式决定。 一般来说，表达载体含有以下几种基本元件：骨架序列、选择标志基因、表达盒以及一些特殊的调控序列。除骨架序列外，其它元件对抗体的高效表达均存在一定的影响。,载体系统分类,根据工程细胞克隆中目的基因拷贝数

13、能否扩增，表达载体可分为两类：A 可扩增表达载体系统。B 不可扩增表达的载体系统。 有一类特殊的选择标志基因可以在外界逐渐增高的选择压力下实现在宿主细胞染色体上的基因拷贝数的扩增，并且可以连带两侧的序列一同扩增，从而提高产量。,二氢叶酸还原酶(DHFR),目前报道的基因工程抗体的高效表达载体系统无一例外地采用了可扩增表达的载体。上述的可扩增选择标志基因目前主要包括有二氢叶酸还原酶(dhfr)基因和谷氨酰胺合成酶(GS)基因，其中使用最久、最广泛、效果最好的dhfr基因。 dhfr基因编码的DHFR是细胞代谢途径中的一个重要的酶当细胞缺乏此酶或此酶失活时必须依靠在培养基中添加次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱

14、氧核核苷才能存活。,甲氨蝶呤(MTX)是 DHFR的类似底物可竞争抑制DHFR的活性。当环境存在高浓度的MTX，dhfr基因可自发在染色体上扩增共拷贝数，以产生更多的DHFR来维持细胞的正常代谢，当其扩增时，可以连带它两侧的序列一起扩增，dhfr基因共扩增的序列的大小通常比该基因要大许多，甚至可以达到上千个kb，足以包含其两翼的目的抗体基因，这种共扩增也就实现了目的抗体基因的基因剂量的扩增，从而极大地提高表达产量。,dhfr基因在CHO细胞中扩增时能在染色体上形成较稳定的多拷贝序列，存在于宿主细胞染色体中。因此选择可扩增表达系统时最好选择在CHO细胞中表达，另外内源性dhfr基因的存在会降低外

15、源性dhfr基因带动扩增目的基因的效果。因此应该选择dhfr基因缺陷的CHO-dhfr -细胞，以达到抗体的最高表达。,谷氨酰胺合成酶(GS),利用GS基因也可对目的基因进行扩增；GS基因是一种显性基因扩增选择标志基因，在染色体上可以有较高的扩增倍数，像dhfr基因一样，扩增时连带两侧序列一起扩增。在外界存在蛋氨酸磺酰胺(MSX)时。不表达或弱表达GS基因的细胞受到MSX的显性筛选死亡，而GS基因表达较高的细胞则能存活。细胞对MSX的耐受浓度与GS基因的表达水平呈剂量依赖关系，提高MSX的浓度将要求细胞有更高水平的基因表达造成GS基因和目的基因的扩增，达到目的基因的高表达。,表达载体的表达盒,

16、每一个表达载体均带有目的基因的表达盒，表达盒一般包括启动子、克隆位点以及转录终止信号。 因为抗体分泌前导肽通常适用于多种抗体基因，所以还可以将抗体分泌前导肽也包含在表达盒中。另外，还可以在抗体分泌前导肽前再加上一些特殊的表达调控序列。抗体基因表达盒的组织形式己较为固定，但其中各元件的选择仍然有值得探讨的地方。,1 启动子,抗体基因表达盒中最关键的元件是驱动抗体基因表达的启动子以及相应的增强子。所有的真核启动子都含有两个基本组成部分，TATA盒和其下游的富含GC的序列，TATA盒确定了转录起始位点，富含GC的序列则决定转录起始频率，因而不同的启动子产生不同的转录起始频率。 目前使用的哺乳类细胞表

17、达系统的启动于主要有病毒启动子，如SV40早期基因 和晚期基因的启动子、人巨细胞病毒立早基因启动子、病毒的长末端重复序列(LTR)等；哺乳类动物细胞基因的启动子，如转录因于EF-1的启动子、人干扰素-的启动子、各种鼠IgG启动子等。,2 核糖体进入位点,启动子下游有真核的核糖体进入位点，它对于所有的抗体基因的表达都是必要的。真核的核糖体进入位点通常为GCCGCC A/GCCAUGG+4的共有序列，它通过调控核糖体进入mRNA起始翻译的频率来影响目的基因的翻译效率，从而影响目的基因的表达水平。通常载体均带有核糖体进入位点，但其起始翻译的效率并不太高。前面提到的IRES具有较强的起始翻译的能力。最

18、近的一些研究发现在某些哺乳动物细胞的基因前，存在某些类似IRES的序列、可以独立启动翻译，并且产生的翻译效率很高，可以称之为翻译型增强子。,3 转录终止信号和polyA加尾信号,载体的转录终止信号和多聚腺苷酸(PolyA)加尾信号也在很大程度上影响抗体基因的表达。转录的终止和polyA尾巴的合成影响mRNA的有效合成和稳定性。强转录终止信号和加尾信号可提高胞浆中能进行有效翻译的mRNA浓度，提高表达水平 。目前使用最广泛的是牛生长激素的转录终止信号和加尾信号(BGH poly A site)，它的转录终止作用强于SV40的。虽然它也能有效地终止转录，并在以前被广泛采用，但最近的高效表达载体已极

19、少采用。 另外的此转录终止信号和加尾信号也有被采用的，如人-actin的polyA和抗体本身的poly A site，均获得满意的效果。另外，将两个转录终止信号和加尾信号串联使用也可能增强终止转录的强度，例如同时利用抗体恒定区基出组序列的转录终止信号和加尾信号以从载体上具有的BGH polyA信号。,(二)抗体高效表达的其他因素,1 抗体基因的结构2 抗体表达克隆的筛选3 宿主细胞的选择和筛选,有内部核糖体进入位点,invitrogen,Qiagene,第二节 大肠杆菌表达系统,一 大肠杆菌表达系统的特点 是应用最广的源和表达系统， 产量高 ， 成本低 ， 周期短等特点。以下简述原核表达载体的

20、构成元件及特点,表达策略,一、基因表达信号如果将外源基因插入标准的克隆载体，不可能合成重组蛋白，因为基因的表达依赖于基因周围的一组信号，这些信号必须能被细菌识别。这些信号都是一些短的核苷酸序列，为转录和翻译提供信号，三个最重要的信号：1） promoter: 是转录起始信号，在E. coli中，启动子必须能被RNA聚合酶的sigma亚基所识别。2） Terminator：转录结束的位点，终止子一般是可以自我配对形成stem-loop的核苷酸序列。3） 核糖体结合位点：能被核糖体识别的位点，转录成mRNA分子后，核糖体在这一位点上结合。高等生物的基因也被表达信号所包围，但他们的核苷酸序列与E.

21、coli的并不相同。比较E. coli和人类的启动子，有一些是相同的，但是E. coli的RNA聚合酶不可能结合到人类的启动子上，细菌不能识别人类基因的表达信号。,解决的方法是将外源基因插入载体中，使其处于一系列的E. coli表达信号的控制之下。这样基因可以转录和表达。克隆载体提供了表达的信号，所以可以用来生产重组蛋白，被称为表达载体。 （一） 启动子启动子是表达载体的最重要的组成成分，这是因为启动子控制了基因表达的第一个阶段，决定了mRNA合成的速度。获得重组蛋白的数量很大程度上取决于表达载体所携带的启动子。,所有E. coli启动子都有两个保守序列，保守序列的变化是影响转录效率的主要因素

22、。强启动子可以启动高效率的表达，合成大量表达产物。相反，弱启动子，在细胞中表达量较低。表达载体应该含有强启动子，这样克隆的基因可以以最高的速度表达。建立表达载体的另一个需要考虑的因素是启动子的调控，主要有两种调控方式：诱导：一个诱导的基因是在加入底物后基因的表达才能启动抑制：可抑制的基因是在加入调控物后表达被关闭。,a) 启动子的选择,真核原核启动子差异,基因调控是一个复杂的过程，启动子的参与仅仅是间接的。许多参与诱导和抑制的序列存在于启动子的周围。所以诱导和抑制启动子的化学试剂也同样调控克隆基因的表达。如果重组蛋白对细菌有害，其合成必须严格控制在毒性的水平之下。可以利用调控物抑制基因的表达。

23、即使重组蛋白对寄主细胞无害，仍然需要调控克隆基因的表达，因为持续的高水平表达可以影响重组质粒的复制，最终导致表达产物的下降。,b) 表达载体应用的启动子,几种使用频率最高的启动子：1) lac启动子：控制编码-乳糖苷酶的lacZ基因转录的序列，可以被IPTG所诱导，所以加入诱导物后，可以诱导启动子下游的外源基因的表达。2) trp启动子：色氨酸启动子可以被色氨酸抑制，也可以很容易的被3-吲哚丙烯酸诱导。3) tac启动子：是lac和trp启动子的杂交分子，比两者都要强，同样可以被IPTG所诱导。4) PL启动子：是负责 DNA分子转录的启动子之一。PL启动子是可以被E. coli RNA聚合酶

24、所识别的强启动子，转而转录噬菌体DNA。该启动子可以被cI基因产物所抑制。携带PL启动子的载体使用温度敏感的E. coli cI突变体。在较低的温度下，突变体所产生的cI蛋白可以抑制 PL启动子，在较高的温度下，蛋白失活可以导致克隆基因的转录。,启动子下游的SD序列,启动子下游需有SD(Shine and Dalgarno)序列，这段序列是核糖体结合位点(RBS)的一部分研究发现SD序列为UAAGGAGG时比AAGGA翻译效率高，起始密码子ATG与SD序列UAAGGAGG的最适距离为6-8bP，与A AGGA的距离5-7bP为好，在分泌表达时需要有前导序列，大肠杆菌中比较常用的几种前导肽序列为

25、pelB(果胶酶基因)、OmpA(外膜蛋白基因)、OmpF等 ，使用何种前导肽对产量影响并不大。,解释SD序列,SD序列（Shine-Dalgarno sequence）：mRNA中用于结合原核生物核糖体的序列。原核生物中，核糖体受一段富含嘌呤的SD序列引导从而识别AUG起始密码。这段位于AUG上游的序列和30S核糖体亚基的16s rRNA一段序列互补，保守区5-UAAGGAGGUGA-3，核糖体结合位点RBS和起始密码AUG之间的距离以及碱基的组成对翻译的效率有显著影响，在设计的时候要注意。而真核生物的那段保守序列成为Kozak序列（5-GCCACCAUGG-3），要高效翻译，+1G和-3A

26、就很重要。不过如果mRNA没有这段Kozak序列而有一段适当长度5UTR也能够有效地在无细胞体系中得到翻译。有趣的是，还有数据提示，大肠杆菌的核糖体通常只认得SD序列，而真核比如网织红细胞的核糖体能识别Kozak序列，也能识别SD序列。,表达产物中需要加入tag,在表达产物中加入标签序列(tag squence)后可以方便地利用ELISA等常规的免疫学方法进行活性检测、定量及亲和层析纯化产物；通常这段标签位点都置于产物的C-末端，这样一般不会影响抗体片段的活性，在进行直接ELISA时也能保持标签位点的活性。目前常用的标签序列有组氨酸串、FLAG、c-myc10肽及Strep标签。组氨酸串为5-

27、6个组氨酸，它可以与Ni+、Zn2+及Co+等阳离子结合，因此带有His的抗体片段可以通过金属螯合层析,富集、纯化。疏水性多肽序列DYKDDDDK被称为“FLAG”也可用于检测和纯化重组蛋白，它的特点是既可置于N末端，又可置于C末端。C-myc10肽是鼠单克隆抗体9E10的结合表位该标签的特点是特异件很高。Strep是一段合成的9肽，其序列为AWRHPQFGG，它能与链亲合素(streptavidin)结合，用于柱层析纯化，其不足之处是只能连于C末端。经改进的strep tag II (SNWSHPQFEK)的亲和力有所降低，但可以连于N端发挥作用。,二、重组抗体片段的可溶表达,由于可溶表达的

28、抗体可能对宿主菌产生毒性，因此可溶表达载体应选用严格调控的诱导型启动子来降低本底，过强的启动子因为对大肠杆菌的分泌、加工能力要求过高而并不能增加分泌表达的产量，有时甚至会降低可溶表达的产量，诱导的强度和持续时间也会影响产物的正确折叠，多数情况下可以利用降低温度来增加可溶表达的产量，经验值为24-32度。,(一)可溶表达的实验方案,从新鲜涂布的平板上挑取单菌落，在起始培养基中培养后转接入50ml含抗生素的丰富培养基(2YT或LB)中培养，如果要进行更大体积的培养，则应将单菌落接种在4ml丰富培养基中37度培养4-8h，然后再以此培养基转接至大量培养基。如需过夜培养应该在30度或更低温度下培养，而

29、不宜在37度培养过夜。诱导在37度培养至OD600约为0.4-1.0时开始进行。诱导条件因启动子不同而异，参见表7-2。加入诱导物后继续振荡培养3h或过夜培养诱导进行的时间取决于启动子的特性和诱导温度。以下列出不同温度下诱导培养的时间的经验值：15-25度过夜诱导、30度诱导5-6h或更长时间、37度诱导3-4h。,（二）可溶表达条件的优化,1 质粒拷贝数 （适中）2 mRNA的数量与蛋白质的稳定性3 抗体片断的折叠与组装,第三节 抗体在酵母及昆虫细胞中的表达,一、昆虫表达系统及其在基因工程抗体中的应用 1 以重组杆状病毒为载体的昆虫表达系 统。 2 杆状病毒表达载体（宿主细胞为sf9） 3

30、杆状病毒表达系统的效率与加工能力 4 稳定转化的昆虫表达系统,多核多角体病毒MNPV特点：,1 具完整的感染性2 不依赖辅助病毒3 表达产物多半可溶4 在自然界生存时间短暂，安全。5 不能感染脊椎动物。,Invitrogen公司,新式杆状病毒和昆虫细胞表达系统,特点：外源基因表达产量高（1-500mg/L）；昆虫细胞培养条件简单；昆虫病毒宿主范围窄，不感染脊锥动物细胞，具较高的安全性。转化方式：同源重组：磷酸钙共沉淀法,启动子：多角体蛋白启动子：非常强，其控制的外源蛋白的表达可达到细胞蛋白的30。P10蛋白启动子已有系统：Clontech公司的BacPAKTM杆状病毒表达系统，IPLB-Sf2

31、1 Cells，提供两个转移质粒：pBacPAK8和pBacPAK9,BaculoDirect杆状病毒表达系统是生产重组杆状病毒最快和最容易的方法 不需要烦琐的细菌转化和bacmid的分离，或是将转移载体和线性杆状病毒DNA共转染进昆虫细胞。经过生物工程改造的BaculoDirect线性DNA（杆状病毒基因组），利用快速和有效的Gateway重组反应代替了这些烦琐的工作。 使用BaculoDirect系统，从最初的反应混合物的转染到杆状病毒苗的分离，只需要花费大约8小时仅花费了不到传统方法一半的时间！,BaculoDirect系统利用快速、简便的Gateway技术。 BaculoDirect线

32、性DNA包含了attR位点，允许与包含有目的基因的Gateway入门克隆进行有效的重组。 将entry克隆、BaculoDirect线性DNA和GatewayLRClonase酶混合物稍加混匀，在室温下反应1小时即可。 最终的反应混和物中包含有携带目的基因的杆状病毒，可以直接用于转染昆虫细胞（sf9或sf21）。,酵母表达载体,一、外源基因在毕赤酵母中的表达,特 点：酵母生长快，易培养，成本低，遗传操作方便，对外源蛋白能进行翻译后修饰和加工。毕赤酵母利用AOX1强启动子或者3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）启动子，可高效表达外源基因。毕赤酵母的细胞密度可达150g/L毕赤酵母可进行糖基化，糖基

33、化位点（Asn-X-Ser/Thr）,毕赤酵母表达外源蛋白通常步骤：外源基因表达载体的构建载体DNA导入酵母细胞筛选表达载体染色体整合的菌株捡出外源蛋白表达情况优化发酵条件建立高密度发酵方法建立外源蛋白纯化工艺,二、酵母表达系统,酵母是一类单细胞真核生物，具备易于操作，遗传背景清楚，生产成本低等原核生物的特点，又具有真核生物的折叠、分泌机制，可以完成真核生物特异的蛋白酶解、折叠、糖基化等翻译后修饰过程。酵母的生长速度（1- 3h /代）比昆虫或其它动物细胞（约 l d/代）快许多，培养基成分简单。使用无血清培养基更可以简化蛋白产物纯化过程，在酵母表达系统中应用最多的是酿酒酵母和毕赤酵母。酿酒是

34、使用最早，应用最广的酵母菌株但目前有被毕赤酵母取代的趋势。与酿酒酵母相比毕赤醉母有几个突出的优点，它的乙醇氧化酶基因（AOXI）是一个甲醇诱导表达的严格调控基因，启动活性高，渗漏低在加人甲醇后可以迅速启动转录；它比酿酒酵母更适合高密度培养，这对于提高重组蛋白的产量至关重要；它的 N 糖基化方式也更接近高等真核生物。对该体系的载体构建、表达特点和体系优化已经进行了系统研究。,（一）酵母表达系统的特点,在酵母表达系统中常用的载体可按复制形式分为 Yip、 Yrp 、Ycp、 Yep和YAC几种。pPIC9K 为常用的酵母表达载体，其组成元件如图，一 3 所示。除AOXI启动子外常用的还有 GAL

35、系列启动子；分泌表达还需要前导肽将产物引导至分泌途径酵母天然的前导肽不一定适用于所有外源蛋白，来源于酿酒酵母的-MF 前导肽为常用的前导肽。检测或分离重组蛋白可以选择 His、c-myc等与大肠杆菌的质粒载体相似的标记序列。,研究发现在E coli中以包含体方式表达的蛋白在酵母中大都能可溶表达，征大肠杆菌中经常发生的蛋白降解现象，在酵母中也有所改善。酵母表达系统的产量比原核表达系统要高在适当的前导肽引导下可以分泌到培养基中，其培养基中的污染物种类很少有助于简化纯化过程。 wood等于1985年就在酿酒酵母中成功地表达了能正确折叠、并且有生物功能的完整抗体分子 。到目前为止，完整的抗体、抗体片段

36、如Fab、ScFv等抗体分子均已在酵母中得到表达。分泌的重组抗体片段在酵母中也可以高水平表达。,(二)酵母表达抗体片段的局限,酵母可以完成和高等真核生物极其类似的O-糖基化及N-糖基化，但酵母的O和N-糖基的主要成分为甘露糖。N-糖基化时添加的糖链长度会影响所表达蛋白的性质。在酵母中的糖链(50个糖基)比哺乳动物的糖链(20个糖基)长许多，称为过度糖基化。这种过度糖基化产生的长链可能会影响蛋白的折叠，影响抗体的活性，具有免疫原性。有人报道酵母表达的IgG抗体虽可以介导ADCC，但却不能激活补体系统。,这类抗体分子还因为可能具有免疫原性及在血液中易被消除而不适用于临床治疗。抗体分子在酵母表达时会

37、否发生过度糖基化以及这种过度糖基化是否合影响抗体的活性还很难确定。酵母表达系统的不足之处还在于它的分泌表达模式与高等真核生物的差别会造成某些蛋白不能正常分泌而滞留在分泌途经中。这可能是因为酵母对前导肽的识别能力以及细胞器的功能与高等真核生物不同，改用酵母天然的前导肽可以改善某种蛋白的分泌状况，但不具有普遍意义。,第四节 动植物表达系统,一 动物表达系统二 植物表达系统,一、哺乳动物细胞表达系统,特点：能进行复杂的蛋白翻译后加工修饰,1、影响外源基因在哺乳动物表达的序列因素,启动子：起始位点上游20bp处的TATA盒RNA聚合酶开始装配和转录的地方CAAT盒GC盒调节转录的起始。,增强子：增强子

38、序列是决定基因表达强度基因表达空间与时序的重要元件。SV40增强子人巨细胞病毒（CMV）增强子逆转录病毒LTR增强子,RNA剪接位点和内含子：内含子一般含有决定基因表达强度和时空专一性的构件，一些启动子可和内含子相互作用提高表达水平。5非翻译区序列（5UTR）：5UTR的长度至少大于20bp起始AUG及其周围序列：3非翻译区（3UTR）：,已发展和使用的病毒载体有：SV40病毒载体，腺病毒载体，多瘤病毒载体，牛痘痘苗宾服度载体，单纯泡疹病毒载体，逆转录病毒载体，腺病毒相关病毒载体，EB病毒载体，牛乳头瘤病毒载体等。,2、哺乳动物细胞的表达载体,3、筛选标记基因,是细胞产生特定的药物抗性或产生荧

39、光。常用的筛选标记有：氨基糖苷转移酶（APH或neor），潮霉素B磷酸转移酶（hyg），二氢叶酸还原酶（dhfr）等,4、外源基因在哺乳动物细胞中的表达方式,瞬时转染：永久转染,5、外DNA导入哺乳动物细胞的方法,病毒方式：逆转录病毒、腺病毒、痘苗病毒、泡疹病毒、腺病毒相关病毒,磷酸钙共沉淀法、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法、阳离子聚合物法,显微注射，电转移法、基因枪,转染：,化学法：,物理法：,四、基因表达产物的检测,基因转录水平的检测：Northern Blot，RNA杂交保护，RT-PCR蛋白翻译水平的检测：ELISA、Western Blot，高压液相，质谱等生物活性的检测：,第六

40、章 基因打靶,概念：基因打靶，基因敲除，干细胞，基因敲入基因打靶的技术流程,基因打靶,胚胎干细胞的获得和培养打靶载体的构建重组ES细胞的筛选嵌合体小鼠的制备基因敲除小鼠的建立Cre-loxP系统、FLP/FRT系统和条件性基因敲除基因敲入大规模ES细胞突变库的建立,概 念,干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞，可分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞（Embryonic Stem Cell，ES)：ESC是从早期胚胎内细胞团（Inner Cell Mass，ICM）或附置后胚胎原始生殖细胞（primordial germ cells ,PGCs)分离克隆出来的一种具无限增殖能力和全向分化能

41、力的干细胞。,胚胎干细胞的定义：,ES的特点：（1）全能性这个特点是ES细胞具有可塑性的基础，优于成年组织干细胞。（2）无限扩增为实验和应用提供了大量的原材料或工具。（3）可操作性导入异源基因，报告基因或标志基因，诱导某个基因突变，基因打靶或导入额外的原有基因使之过度表达。,胚胎干细胞（ES细胞）：是一种具有分化潜能的细胞，在体外培养条件下能无限分裂并保持其全能性。一定培养条件下，ES细胞能在体外形成拟胚胎，具中胚层、内胚层和外胚层特征。将ES细胞注入小鼠囊胚，该囊胚能在体内发育成嵌合小鼠，注入的ES细胞能发育成小鼠的各个组织器官，包括生殖细胞。ES细胞的这些特点为原位定点改造小鼠个体的基因组

42、创造了可能。,基因打靶：是利用同源重组技术来定点改变物种的基因组顺序和结构，从而在突变的个体内来研究基因及基因组的功能。,基因敲除：是使基因组中某个/某几个基因或基因的顺式元件产生缺陷，从而在突变体内丧生正常的功能，来推测这些基因或元件原来在体内的功能。基因敲入：在个体基因组中定点加入某个/某几个基因或顺式元件，使之表达或发挥作用，从而研究该基因或顺式元件在体内的功能。,基因打靶技术是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段。它的产生和发展建立在胚胎干细胞技术和同源重组技术成就的基础之上，并促进了相关技术的进一步发展。 自1987年早期胚胎干细胞技术建立及第一例基因剔除小鼠诞生以来，基因打靶的研

43、究进展迅速，给现代生物学和医学研究带来了革命性的变化，并直接引发了现代生物学和医学研究各个领域中许多突破性的进展，成为后基因组时代研究基因功能最直接和最有效的方法之一。,基因打靶流程图,一、胚胎干细胞的获得和培养,基因打靶中用的小鼠ES细胞系有：D3、E14、R1、J1、CCE，均来源于129小鼠品系和其杂交品系。ES623和B6-IIIES细胞系，来源于C57BL/6小鼠品系。BALB/c-I，来源于BALB/c小鼠品系常用的饲养层细胞为PMEF（小鼠原代胚成纤维细胞）,ES细胞的培养（1）冲洗子宫获得胚泡（2）分离胚泡内细胞团 组织培养法、免疫外科学法、显微外科学法（3）体外培养有饲养层培

44、养：STO(一种已建株的胚胎成纤维细胞),经丝裂霉素C或射线处理，终止其分裂，但能分泌促进ESC分裂抑制其分化的因子。无饲养层培养：利用各种能分泌抑制分化因子的细胞制备条件培养基，或向其中加入LIF（白血病抑制因子）。,1、基因打靶用ES细胞的建株,组织培养法分离胚胎干细胞,1,2,3,ES细胞,转基因动物表达系统表达抗体,在大肠杆菌、酵母或昆虫细胞中都很难获得与哺乳动物翻译后修饰、加工，特别是糖基化方式一致的重组抗体。在细胞培养条件下的蛋白表达与活体条件下的表达和调控也有很大区别。用于抗体规模化生产时，细胞培养的成本过高会制约其应用，小规模培养时这个问题更为突出。利用转基因动物作为生物反应器

45、来生产重组抗体可以解决这一难题。目前转基因方法很多，在转基因小鼠上广泛应用的主要有两种方法： 当基因整合位点不是主要因素时，将DNA直接注射到受精卵的精核中可以向小鼠基因组引入新基因； 把DNA引入胚胎干细胞(ES细胞)的培养物中，这种办法通过基于同源重组的基因敲除来获得目的基因的稳定表达，这两种转基因的过程见图7-6。,(一)乳腺特异的调控序列,目前主要是在转基因动物的乳腺中表达外源蛋白，在乳腺中表达的抗体片段大多是与乳腺特异调控序列融合表达的嵌合蛋白，许多编码乳汁成分蛋白的调控区被用于重组蛋白在乳腺中的定位表达，如羊的-乳球蛋白，牛的-酪蛋白等。这些调控序列在应用时对抗体的表达量无太大影响

46、，也没有明显的种属特异性，但相同的抗体片段融合于不同的调控区时，表达量有所差异。用于表达的抗体基因既可以是包括内含子的基因组DNA，也可以用cDNA。然而将外源抗体的cDNA序列连在这些调控区下游时却很难获得高效表达，选用较大的基出组片段(20kb)效果要好许多。,（二) 转基因动物的选择,小鼠、羊、牛和鸡等多种动物都可用于转基因的研究和生产。选择何种动物主要考虑产量和所表达抗体的性质。,植物表达系统,利用转基因植物作为生物反应器来生产重组蛋白始于20世纪80年代，伴随这项技术的日臻完善，出现了诸如“分子农业”以及“变植物为工厂)”等概念。在植物表达系统中生产的抗体称为植物抗体(plantib

47、ody)，它们可以是FV、ScFv、Fab乃至全长抗体，要获得临床前及I期临床实验用转基因植物约需2年左右时间。利用植物表达外源蛋白有许多优点，首先植物繁殖能力强，可以利用愈伤组织或原生质体连续培养也可以从这些材料出发获得再生植株，这方面已经积累了很多的经验。其次，大多数植物的基因转化都是把外源DNA整合到基因组中去获得转基因植株，这样就可以利用有性杂交在材料间转移基因。,在植物转化中应用最多的方法是农杆菌介异的转化。利用不同的启动子可以实现 ScFv在细胞质、内质网、叶绿体及细胞间隙中的表达。农杆菌胭脂碱 合成酶基因（nos） 和花椰菜花叶病毒（ CaMV ) 的 35s启动子是常用的启动子

48、单子叶植物更多使用泛素的启动子。此外也可选择组织器官特异的启动子，抗性基因的选择以新霉素磷酸转移酶（nptII） ，潮霉素磷酸转移酶（hpt ）及氯霉素乙酰转移酶（cat ）为主。也可以使用葡萄糖甘酸酶（ GUS ） 及绿色荧光蛋白（GFP) 等报告基因作为筛选标记。 pBin19 是应用较广的Ti质粒载体其基本结构如图 7-4 。,Ti质粒的特点,Ti质粒载体示意图,（一）全抗体及Fab片段的表达,到目前为止 IgG、IgM 、IgA等多种形式的抗体和各类小分子抗体片段都可在植物细胞中表达。最初是采用分别转化了重链和轻链基因的转基因植株进行杂交。从后代中筛选出能生成全抗体的个体。199 9年During 等将轻、重链基因克隆入同一个表达载体中后转化烟草。这样可以简化操作程序，缩短育种年限。全长抗体要完成正确的折叠和装配过程才能成为有功能的抗体分子。在哺乳动物细胞中新合成的蛋白质在前导肽的指导下进人内质网内腔，前导肽在内质网中切除。已知至少有两种胁迫蛋白Bip/GRP78 和GRP94作为分子伴侣与未经组装的轻、重链结合，指导其完成在内质网内的折叠与组装。在植物中完成组装过程时，轻，重链要同时带有前导肽。此前导肽可以来源于小鼠、植物或酵母。,