结肠癌组织蛋白质组成分的双向凝胶电泳分析.doc

1、结肠癌组织蛋白质组成分的双向凝胶电泳分析【摘要】 目的 分析结肠癌病人癌组织、癌旁组织及正常结肠黏膜组织双向凝胶电泳的蛋白质表达图谱，寻找差异表达的蛋白质。方法 采用固相 pH 梯度双向凝胶电泳分离结肠癌病人配对癌组织、癌旁组织及正常结肠黏膜组织的总蛋白，银染显色，PDQuest 2DE 软件分析差异表达的蛋白质点。结果 获得了重复性较好的双向凝胶电泳银染图谱。图像分析显示，3 组胶的平均匹配率分别为：癌组织 87.3%、癌旁组织 80.3%、正常结肠黏膜组织 84.0%。等电聚焦方向上的平均偏差为（1.160.29）mm，十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE) 方向上的平均偏差

2、为（1.000.38）mm。差异分析共获得 164 个差异表达的蛋白质点。结论 双向凝胶电泳分离结肠癌组织的总蛋白可获得重复性较好的结果。获得的差异蛋白质点为寻找结肠癌早期诊断的分子标记物提供了理论依据。 【关键词】 结肠肿瘤 蛋白质组学 电泳 凝胶 双向 ABSTRACT Objective To study the protein expression profiles of colon cancer mucosa, mucosa adjacent to cancer, and normal colon mucosa and detect the differential expressi

3、on proteins. Methods Immobilized pH gradient twodimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2 DE), silver staining and PDQuest 2 DE analysis software were used to separate and analyze the proteome of cancer mucosa, mucosa adjacent to cancer and normal mucosa. Results The 2 DE images were analyze

4、d by PDQuest 2 DE software. The mean matching rates of the cancer, paraneoplastic and normal mucosa were 87.3%,80.3% and 84.0%, respectively. In IEF direction, the average deviation was (1.160.29) mm, in SDSPAGE direction, the deviation was (1.000.38) mm. Using subtractive analyses of protein patter

5、ns of the cancer, paraneoplastic and normal mucosa, 164 different expression protein spots were screened. Conclusion Good reproducibility and resolution could be obtained by applying immobilized pH gradient twodimensional polyacrylamide gel electrophoresis to separate and analyze the proteome in the

6、 tissues mentioned above. Proteins screened provide an evidence for searching markers of early detection of colon cancer. KEY WORDS Colonic neoplasms; Proteomics; Electrophoresis, gel, TwoDimensional 结直肠癌是当前全球最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在我国呈逐年上升趋势。近几十年来，随着基因组学研究的不断进展，结直肠癌的发病机制得到一定的阐明，诊断和治疗上也取得了重大进展，但对病人的临床处理

7、和预后没有实质影响，究其原因主要是不能解决早期诊断的问题1。蛋白质组学的出现使人们能直接从蛋白质的整体水平动态定量地考察肿瘤发生过程中蛋白质种类、数量的改变，有助于寻找肿瘤早期诊断和预后的特异性标记物及有效的治疗靶标24。本文利用固相 pH 梯度 双向凝胶电泳（2DE ）和 2DE 凝胶分析软件，从整体水平上观察、分析结肠癌病人癌组织、癌旁组织及配对正常结肠黏膜蛋白质表达差异，旨在建立三者间的蛋白质表达差异图谱，为进一步寻找与结肠癌发生、发展相关的分子标记物提供理论依据，进而服务于结肠癌的临床诊断和治疗。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 标本 手术切除的 4 例配对结肠癌组织、癌旁黏

8、膜组织（距离癌组织5 cm） 、正常结肠黏膜组织（远端切缘） ，由浙江大学附属第二医院病理科鉴定并提供，-70 贮存备用。病人术前未接受任何治疗。 1.1.2 试剂 尿素、甘氨酸、Tris、SDS、过硫酸胺、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、3(3 胆酰胺丙基) 二乙胺1 丙磺酸（CHAPS） 、二硫苏糖醇（DTT） 、碘乙酰胺、矿物油、固相 pH 梯度(IPG) 缓冲液（Biolyte）及干胶条(pH 47)，均购自 BioRad 公司；硫脲为 Sigma 公司产品。 1.1.3 仪器 Protean IEF cell 等电聚焦仪、Protean Plus Dodeca Cell、PDQuest 2

9、DE 软件、GS800 成像仪，均为 BioRad 产品。 1.2 方法 1.2.1 样品制备 在液氮条件下将组织研磨成粉末，加入细胞裂解液（尿素 7 mol/L， 硫脲 2 mol/L，CHAPS 40 g/L，DTT 65 mmol/L，体积分数 0.002 Biolyte ）并超声，室温静置 20 min，然后用离心机 13 000 r/min、4 离心 1 h，取少量上清用 Bradford 法定量5，其余上清液分装-70 冻存。 1.2.2 固相 pH 梯度双向凝胶电泳 第一向固相 pH 梯度等电聚焦：主要按 GORG 等6的方法和Protean IEF cell 等电聚焦系统指南进

10、行。将总蛋白质提取物（200 g）与水化液（尿素 7 mol/L，硫脲 2 mol/L，CHAPS 40 g/L，DTT 65 mmol/L，体积分数 0.002 Biolyte ，痕量溴酚蓝）充分混合，总体积为300 L。水化和等电聚焦在 Protean IEF cell 上，于 17 下自动进行，程序设置为：被动水化 12 h，250 V 慢速升压 30 min， 1 000 V 快速升压 2 h，10 000 V 线性升压 3 h，10 000 V 快速升压。第二向 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳：等电聚焦结束后，IPG 胶条分别在含 20 g/L DTT 和25 g/L 碘乙酰胺的平衡液（

11、含 6 mol/L 尿素， 20 g/L SDS，0.375 mol/L TrisHCl 、pH 8.8，体积分数 0.20 甘油）中各平衡 15 min。将平衡后的胶条移至 1.0 mm 厚的 120 g/L 的 SDSPAGE 胶，使用 10 g/L低熔点琼脂糖封顶，200 V 恒压电泳至溴酚蓝条带迁移至距底边 12 cm处。银染：用体积分数 0.40 甲醇+体积分数 0.10 冰醋酸固定 1 h；体积分数 0.30 甲醇+2 g/L Na2S2O3+68 g/L 乙酸钠敏化 30 min；水洗 3 次，每次 5 min； 2.5 g/L AgNO3 染色 20 min；水洗 2 min；

12、25 g/L Na2CO3+0.148 g/L 甲醛显影至斑点清晰为止；14.6 g/L EDTA 终止反应10 min；水洗 3 次，每次 5 min。 1.2.3 凝胶图像分析 银染显色的凝胶通过 GS800 扫描仪获取图像，用 PDQuest 软件对图像进行背景消减、斑点检测、匹配和获取斑点位置坐标等，斑点位置的重复性按 CORBETT 等7的方法进行计算。 2 结 果 2.1 结肠癌组织、癌旁组织和正常结肠黏膜组织的双向电泳图谱 在相同条件下对每例病人的正常结肠黏膜组织、癌旁组织和结肠癌组织的总蛋白样品分别进行了 3 次双向凝胶电泳，其总蛋白分布模式非常相似（图 1） 。经 GS800

13、 图像采集和 PDQuest2DE 软件分析，在相同条件下，正常结肠黏膜组织、癌旁组织和结肠癌组织识别的蛋白质斑点数分别为（1 08740） 、 （1 04811）和（1 13711）个，各凝胶中斑点的平均匹配率分别为 84.0%、80.3%和 87.3%。结果表明，第一向等电聚焦（IEF）的平均偏差为（1.160.29）mm，第二向 SDSPAGE 方向上的斑点位置偏差为（1.000.38）mm。 2.2 结肠癌组织、癌旁组织及正常结肠黏膜组织中蛋白表达差异分析 PDQuest 软件分析显示，有 80 个蛋白质点仅存在于癌组织中（图 2） ，有 3 个蛋白质点仅出现在癌旁组织中，有 10 个

14、蛋白质点仅出现在正常黏膜组织中（图 3） ；癌组织与正常黏膜组织、癌旁黏膜组织相比，有 19 个蛋白质点表达上调且大于 5 倍，其中有 1 个蛋白质点呈现从正常到癌旁到癌逐渐增高且增高大于 5 倍的趋势（图 3） ；正常黏膜组织与癌组织、癌旁黏膜组织相比，上调相差 5 倍的蛋白质点有 41 个，其中有 2 个蛋白质点呈现从正常到癌旁到癌逐渐降低且降低低于 5 倍的趋势；癌旁组织中有 11 个蛋白质点消失（图 4） ，有 4 个蛋白质点明显低于正常黏膜组织和癌组织，且癌组织与正常黏膜组织相比，这 4 个蛋白质点的表达上调大于 5 倍。 3 讨 论 蛋白质组学是后基因组时代生命科学研究的一个热点领

15、域，它从动态和整体的角度，研究组织细胞中全蛋白质的表达模式和功能模式，为阐明生理病理条件下生物体的生命活动规律提供了强有力的工具24。目前用于蛋白质组学研究的主要技术之一是双向凝胶电泳技术2,4,6，我们通过反复摸索，建立了分辨率高、重复性好的双向凝胶电泳方法系统，这保证了我们进行肿瘤蛋白质组差异分析的基本条件。在本次实验中，在 IEF 方向上的平均位置偏差为（1.160.29）mm，SDSPAGE 方向为（1.000.38）mm，说明本次实验 2D 电泳的重复性好，所得的结果是可靠的。 结直肠癌的发生是一个涉及多基因、多蛋白改变的复杂过程，原癌基因激活、抑癌基因失活及其编码产物的过度表达，以

16、及 DNA 损伤修复系统缺陷等均在肿瘤细胞的恶性转化和增殖失调中扮演重要角色。为了客观地了解结肠癌发生过程中总蛋白的变化趋势，本文分析比较了 4 例结肠癌病人配对癌组织、癌旁黏膜组织及正常结肠黏膜组织的总蛋白表达图谱，结果得到 164 个有意义的差异表达蛋白质点，这些蛋白质点可能参与了肿瘤的发生和发展。在这些差异表达的蛋白质点中，我们尤为感兴趣的是在癌旁黏膜中表达发生变化的一些蛋白。目前，对癌旁黏膜表达发生变化的一些蛋白的性质尚无定论，有观点认为其产生主要是源于癌组织的旁分泌或癌细胞浸润造成的局部微环境的改变，在分子水平上它反映的是一种癌前病变的状态8。王康等9通过对结肠癌、癌近旁黏膜、癌远旁

17、黏膜和正常组织的研究显示，结直肠癌旁黏膜有一定的癌变潜能，尤其是癌近旁黏膜。本研究结果表明，有 11 个蛋白质点仅在正常组织中和癌组织中有表达，而在癌旁组织中消失；有 3 个蛋白质点仅出现在癌旁黏膜中；还有 4 个蛋白质点在癌旁组织中的表达明显低于正常组织和癌组织。说明某些蛋白质在癌症的发生过程中起一过性的作用，它们可能在启动正常结肠黏膜细胞恶性转化、去分化和其他表型与生物学特征改变的过程中起重要作用，当细胞发生恶性转化进入演进期后，其作用迅速消失。因此，我们认为，在癌旁黏膜中出现变化的这些蛋白质可能是细胞即将发生癌变的指示剂，对它们进行鉴定将有助于我们寻找结直肠癌早期诊断和预防的分子标记物。

18、 当然，单纯的双向电泳并不能满足蛋白质组学研究的需要，我们进一步的工作是对筛选出来的这些差异蛋白质点进行质谱分析，明确这些蛋白质的身份及生物学功能，阐明其在肿瘤发生的各个阶段中的具体作用，并对其在临床诊断和治疗上的应用进行可行性评估。 【参考文献】 1来茂德. 结直肠癌发生的分子机制研究进展J. 中华病理学杂志, 2000,29(6):450452. 2REYMOND M A, SCHLEGEL W. Proteomics in cancerJ. Adv Clin Chem, 2007,44:103142. 3WU W, HU W, KAVANAGH J J. Proteomics in ca

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