抗生素作用新靶点的发掘策略.doc

1、抗生素作用新靶点的发掘策略作者：谢练武 李翔 欧阳永长 姜淑梅 秦岭【摘要】 抗生素的大量使用和滥用所造成的细菌广泛的耐药性迫使科研人员要加速寻找结构新颖的抗生素。抗生素作用靶点的发掘对药物发现非常重要，本文综述了近几年来国际上运用基因组学、基因芯片等现代生物信息学技术，利用细菌体内的各种酶反应与理化特性，发掘抗生素传统作用新靶点如脂肪酸合成酶、非传统作用新靶点如双信号转导调控系统、群体感应器等的研究进展，这对新抗生素的发现具有一定的指导意义。 【关键词】 抗生素； 新靶点； 耐药性； 基因组学ABSTRACT Widespread bacterial drug resistance orig

2、inated from massive uses and abuses of antibiotics drives drug discovery in a remarkable speed path. At the same time, finding functional target of antibiotics was extremely important to the drug evaluation. Novel targets can be found through modern biological information technology such as gene chi

3、p technique and genomics, along with bacterial enzymatic reactions in vivo and the physiological characteristics. In this paper, we summarized some novel antibiotic targets from traditional bacterial functionality and nontraditional domains in these last few years, including fatty acid synthases, tw

4、o-component signal transduction systems and quorum-sensing systems. These new research progresses on novel targets will be a positive strength in novel antibiotic discovery.KEY WORDS Antibiotics; Novel target; Drug resistance; Genomics1941 年人类首次实现青霉素的工业生产，启动了抗生素应用的历史。随后 30 多年的研究先后发现了 -内酰胺类、四环素类、氨基糖苷

5、类、大环内酯类和多肽类、多烯类等几大类抗生素，并成功地应用于治疗各种病原微生物感染。科学界一度乐观地认为，持续不断地发现新抗生素药物将最终使人们彻底摆脱感染性疾病。然而，随后的 40 年，尽管药物研究的投入越来越大，却很少有新碳骨架化合物作为临床药物得以开发。近些年来，由于过度使用抗生素，特别是滥用抗生素，病原菌日益广泛的耐药性已成为药物治疗中越来越常见的问题13 ，人们迫切需要寻找新的抗生素药物。为了克服细菌的耐药性，特别是多重耐药性问题，人们需要运用新的思路去发掘新的抗生素。20 世纪 90 年代以来，随着基因组学、蛋白组学和生物信息学的迅猛发展，人们获得了丰富的基因信息与数据，阐明了上千

6、个蛋白新靶点。一些影响细菌生长和致病的关键基因的发现以及以此为靶点的相应筛选模型的构建是发现抗耐药细菌的新抗生素的关键。本文综述了近年来科学家们发掘抗生素作用新靶点所采取的方法、主要靶点类型和有关作用机制。1 运用基因组学来开发抗生素新靶点基因组学是为了阐明各种生物基因组中碱基对的序列信息，破译相关的遗传与功能而形成的一门基础学科。目前，国际上已经完成了人类、多种细菌等微生物、多种昆虫、多种啮齿类动物的全基因组序列测定工作。从致病与非致病微生物的基因组序列与功能研究中发掘抗生素的新靶标，是生物信息学、病原微生物学和药物化学等多学科综合、交叉的研究领域，有关研究不仅开辟了药物研究的新领域，也将为

7、微生物及其活性产物的利用开辟新的研究热点。目前运用基因组学开发抗生素新靶点的主要研究方法概括如下。1.1 寻找细菌致病开放阅读框为成功研发新药，人们不断运用各种手段来筛选抗菌药物作用靶点4 ，一般首先考虑以下三个筛选标准：运用生物信息学寻找所有潜在药物靶细菌体内保守的开放阅读框(ORFs)；发现一些只在原核细胞中出现，而不在真核细胞特别是高等真核细胞中出现的 ORFs；运用药物靶细菌体内功能基因敲除技术来验证这些 ORFs 是否决定了一个或多个病原菌的致病力。符合以上三个筛选标准的基因就是最佳的备选靶标基因。Rosamond 等5通过 30 多个微生物基因组的生物信息学分析寻找到了多个药物作用

8、靶点，这些靶点影响微生物的生存与繁殖，在病原菌中高度保守，而在人体内或者完全缺失，或者截然不同。他们将大肠埃希菌的 4289 个基因与七种呼吸道疾病致病菌(包括铜绿假单胞菌、流感嗜血菌和肺炎链球菌等)的基因组进行比对，发现所有这些细菌中都有246 个基因高度保守，其中 68 个基因人类缺失；经进一步比对发现，这68 个基因中有 34 个功能未知，其中 16 个是非关键基因，另外 18 个则特别重要，包括喹诺酮和大环内酯抗生素的作用靶点。他们选择这 18 个基因中的 3 个作为靶点基因用于药物筛选，寻找治疗呼吸道疾病的新药，取得了很好的结果5 。1.2 确定关键基因的功能采用各种遗传变异方法确定

9、未知保守基因的功能，如热敏变异、碱基标记诱变、反义 RNA 系统表达以及功能基因敲除等方法6 ，以及鉴定蛋白质性质，确定其是否具有用于药物筛选的潜力。日本研究者从临床分离到耐甲氧西林金葡菌(MRSA)和耐万古霉素金葡菌 Mu50(VRSA)7 ，它们有 70 多个代表基因(总共 2600 个基因)与新的毒性因子有关，这些毒性因子能增强耐药菌株对人的致病力，当然也是更为广泛的潜在抗生素靶点。1.3 阐明关键基因产物的功能有研究者采用高通量基因组结构分析方法8阐明蛋白质 X 衍射结构，根据结构将它们进行分类，在一级结构基础上进行折叠，考察二级结构，并预测三级结构与功能。也有人使用细菌基因芯片或基因

10、表达图谱9 ，评价不同条件下的 mRNAs 表达水平。通过不同浓度抗生素的作用，挑选出最敏感的基因。例如，在含有 97%结核分枝杆菌基因的基因芯片上添加抗结核药物，测试药物对结核分枝杆菌基因表达的影响，了解关键基因产物的生物学功能。1.4 通过基因体内表达确定靶标基因作为基因学方法的补充，确定关键基因后，一般还要通过实验来确定病原菌感染脊椎动物的必需基因，因为有时细菌在培养皿中生长的非必需基因可能是感染动物和人的关键基因。基因如何在体内表达和哪些基因是细菌致病所必需的，一般都要通过体内表达来确定10 ，细菌的基因虽然很多，但在感染动物时只打开特定基因来实现自我生存和繁殖，例如有的基因负责启动生

11、物合成和指导铁离子螯合剂的重新摄取，因为所有脊椎动物宿主的胞内或胞外运铁蛋白上都螯合铁离子。除此之外还需考察筛选得到的抗生素在临床上是否真正有效，以及耐药菌株出现的速率是否降低。总之，通过对细菌基因组的深入研究，可以发现新的药物作用靶点，使药物更特异地作用于特定的位点。2 对某些典型靶点的重新发掘随着基因组研究和对微生物细胞结构与分子机制认识的深入，新靶点不断涌现，为抗生素的研发提供了新的途径，使我们可以深入研究复合靶标的不同部位，以增强筛选的特异性，减少过筛量，提高筛选效率。在细胞壁生物合成、蛋白质生物合成和 DNA 复制与修复过程的传统药物靶点中还是有希望找到一些新靶点，这引起了研究者们的

12、高度兴趣。2.1 抑制细胞壁生物合成的新靶点细菌细胞壁生物合成，尤其是肽聚糖(PG)的合成是第一类天然化合物筛选靶点，也是传统抗菌药物最早的靶点之一，对这类靶点的合成途径和抗生素作用机制的研究比较透彻。那么，针对抑制细胞壁和细胞膜合成是否还存在新的靶点？这里展示几个具有开发价值的研究实例。(1)葡萄球菌糖肽酶 在葡萄球菌 PG 层的生物合成中，肽链之间不是通过 Lys3 和 D-Ala4 直接相连，而是通过五甘氨酸桥联11 。主要的表面抗原蛋白、S.pyogenes 的蛋白 M、咽炎与皮肤损伤的致病因子和金葡菌的蛋白 A 都是通过一段保守的 C 端四肽(LPXT)和五甘氨酸桥共价相连。由于五甘

13、氨酸是在 fem 基因指导下加入的，所以 fem 基因可以成为辅助药物靶点基因，阻断糖肽酶的作用，有望成为降低链球菌感染致毒的好方法。生物信息学分析表明，革兰阳性菌基因组中除了 fem 基因外，还有多个糖肽酶基因。糖肽酶结构阐明后，加快了基于结构的药物设计技术的发展步伐12 。(2)糖基转移酶 多年来人们一直认为糖基转移酶在二糖酰五肽单元聚合到 PG 链上起着关键作用，但由于缺乏实验底物，膜的性质又不是很清楚，分离纯化和结构表征比较困难13 ，没能对之进行系统研究。基因序列分析表明，大肠埃希菌中有 4 种糖基转移酶，而且在初级病原菌中数量众多，有的是糖基转移/转肽复合酶，有的则是单功能糖基转移

14、酶。Ye 等14采用酶联化学法，利用 I 型脂的类似物和糖基转移酶MurG 作用，获得多种脂-二糖酰-五肽 II 型脂的类似物，并进行关于膜的糖基转移酶实验。如果能够合成出较大的碳水化合物库15 ，就能找到抑制糖基转移酶的特异性配体化合物。半合成的 N-芳酰衍生物(如 N-氯二苯-万古霉素和 N-chlorebiphenyl-chloroeremomycin)对 VRE 菌的活性要比它们的糖肽类母体强 80 倍左右。由于这些 N-芳酰糖肽类与 N-酰基-D-Ala-D-Lac 结合的强度没有万古霉素或 Chloroeremomycin 的牢固，有人认为，N-芳酰糖肽类进攻的是糖基转移酶16 。

15、2.2 抑制蛋白质合成的新靶点在第二类传统抗菌药物靶点即蛋白质合成抑制药物的靶点中，我们也有机会发现新的抗生素靶点。这方面的研究以 Belova 等17和Huntington 等18的工作比较突出，其中肽脱甲酰酶已经成为用于新药临床实验的少数几种抗菌靶点之一。(1)核糖体作为抗生素的靶点 抗生素一般结合的是 16S 或 23S rRNA 分子中的关键位点。23S rRNA 第五结构域包含了从肽酰转移酶活性位点到初生肽链19的转运出口肽酰转移酶中心，还包含红霉素(erythromycin)和泰洛星(tylosin)的结合位点20 。第五结构域还与其他抗生素如链阳菌素(streptogramin)

16、和林肯酰氨克林霉素(lincosamide clindamycin)等的结合位点有部分重叠，所以在研究结构时可能找到与 RNA 中一个或多个亚基结合的新抗生素。天然产物晚霉素(eveninomycin)的靶位也是非典型核糖体结合位点18 。晚霉素是一种两端结合着酚酰羧基酯的糖，与 23S rRNA 的 89号和 91 号螺环结合，阻止起始因子 IF2 蛋白与之结合，终止起始氨基酸fMet tRNA 的转运。以硫链丝菌素(thiostrepton)、诺西肽(nosiheptide)和 GE2270A为代表的天然抗生素硫蛋白族21通过阻断一种核糖体伴侣蛋白而抑制蛋白质生物合成。硫链丝菌素和诺西肽攻

17、击 23S rRNA 的 A1087 结构域，同时阻断延长因子 EF-G 在肽酰转移酶位点与核糖体的结合。GE2270A 通过攻击 GTP 酶 EF-Tu 因子来阻断核糖体的肽酰转移反应。从这个基础上研究 EF-Tu 的结构对抗生素的结构与性能优化是非常有意义的。(2)肽脱甲酰酶与甲硫氨酸氨肽酶 细菌在起始因子 IF2 的作用下，以 fMet tRNA 作为起始氨酰 tRNA 开始蛋白质的生物合成。甲硫氨酰的 N-甲酰化保证 fMet 在肽链形成时作为电子供体而非受体，加强了合成起始的方向性。当延长肽链出现在核糖体上时，肽脱甲酰酶(deformylase)酶解掉其 N-甲酰基18 ，然后甲硫氨

18、酸氨肽酶(methionine aminopeptidase)水解脱去甲硫氨酸的 N 端。通过大肠埃希菌的基因敲除分析，认为肽脱甲酰酶和甲硫氨酸氨肽酶是蛋白质合成所必需的，所以它们可以作为抗菌剂的有效靶标。肽脱甲酰酶是一种金属蛋白酶(metallopeptidase)，可被具有金属螯合作用的配体22譬如天然的二肽酰-羟氨酸-放线酰胺素(dipeptidyl hydroxamate actinonin)中的羟氨酸所抑制。这些化合物常用作细菌抑制剂而非杀菌剂，虽然可以降低变种的适应性，但变种出现的频率仍然较快，所以寻找更广谱长效的肽脱甲酰酶抑制剂将成为研究目标。(3)氨酰-tRNA 合成酶 天然产

19、物莫匹罗星(mupirocin)能通过抑制Ile-tRNA 合成酶的作用使异亮氨酸不能参与蛋白质合成。莫匹罗星与金葡菌的 Il-tRNA 合成酶的复合物的分子结构已经阐明23 ，证明它与活性位点配位，并与 Ile-AMP 相互竞争。对其他细菌和真核生物 tRNA 合成酶进行筛选，发现有的化合物对纯化的 tRNA 合成酶具有一定活性，目前暂时还没有发现具有临床价值的类似物，但仍然不失为一个有潜力的靶标。2.3 DNA 复制与修复的新靶点DNA 是生物的遗传物质，具有稳定、多样和自我复制的特点。DNA的双螺旋结构和半保留复制保证了 DNA 在进行准确地复制时，将遗传物质正确地传给下一代，同时保持核

20、酸链的完整性。DNA 实现其功能时需要一系列酶参与反应，包括 DNA 回旋酶。DNA 回旋酶是细菌特有的一种拓扑异构酶，其抑制剂在临床上的应用也越来越广。(1)DNA 回旋酶：新喹诺酮和非喹诺酮的作用靶点 DNA 回旋酶是喹诺酮抗菌剂的典型靶点，也是新喹诺酮分子的作用靶点。新喹诺酮分子层出不穷，包括群体获得性肺炎中抗青霉素肺炎链球菌的抑制物左氧氟沙星(levofloxacin)等。曲伐沙星(trovafloxacin)在 1998 年获批，但因为肝脏毒性而限制临床使用。8-甲氧基喹诺酮莫西沙星(moxifloxacin)和加替沙星(gatifloxacin)在 1999 年获批，它们抗葡萄球菌

21、活性大大增强，可以用于治疗群体获得性肺炎、支气管炎和鼻窦炎24 。各种含有桥头 N，具有 2-吡喏酮环系统的喹诺酮对抗喹诺酮的变异回旋酶仍然具有抑制活性。据报道，克林沙星(clinafloxacin)和西他沙星(sitafloxacin)对回旋转亚基 GyrA 和拓扑异构酶第结构域 ParC的突变型均具有抑制活性25 。(2)RNA 解旋酶 在 RNA 的代谢动力过程中，RNA 与 DNA、RNA 与RNA、RNA 与蛋白质之间能形成并且必须形成具有特异性和较高动力学效率的过渡态复合物。一定长度或全长 RNA 经过折叠、展开和重新折叠，才能实现其生物功能。能将 RNA 分子展开的酶称为 RNA

22、 解旋酶(helicase)26 ，它利用 NTP 水解释放的能量来驱动譬如双链 RNA 的展开。RNA 解旋酶有时作用于原核生物的基因转录、核糖体生物合成、翻译起始和 RNA降解等过程，有时也作用于真核生物的 mRNA 编辑、拼接和 RNA 向细胞质的转运。分析认为，既然 RNA 解旋酶是细菌功能所必需的，那么它可以成为抑制物的作用靶标。3 其他非传统的抗生素作用新靶点前面提到某些新靶点是通过基因组学方法寻找，或从传统靶点中发掘的，除此之外，细菌的酶系反应和生理过程也可作为抗生素的靶点27 。目前已发现几百个新靶点，通过一系列高通量和自动化的筛选实验以及对同簇基因产物的复杂性分析(如某些基因

23、产物在动物体内是毒性因子，在培养基上却不能产生)，可以确定其功能并用于药物筛选。以下介绍几个比较典型的非传统靶点。3.1 脂肪酸合成酶脂肪酸的合成对细菌的生存与发育至关重要。研究结果表明，在I、II 构型亚基中的脂肪酸的合成与聚酮类天然产物的生物合成途径非常相似。在真核细胞中的 I 型酶系中，脂肪酸合成酶(FASs)由多个亚基组成，而大多数细菌的 II 型酶系中 FASs 则为单个亚基，找到特异性抑制物是完全可能的。具有抑制 FASs 活性的天然产物浅蓝菌素(cerulenin)，通过烷基化作用使 FASs 中的酮基合成酶经过环氧化物的开环而造成亲核性 Cys 活性位点失活。选择性更高的抑制物对细菌酮基合成酶会更有效。最近，有人发现三氯森(triclosan)类抗菌防腐剂可阻断大肠埃希菌烯酰-ACP 还原酶 Fab I 催化脂肪酸合成酶的烯键饱和作用，这说明FASs 是较好的靶点。3.2 异柠檬酸裂解酶