抗体生物制品.ppt

1、4.抗体生物制品,抗体的结构、分类与功能多克隆抗体单克隆抗体基因工程抗体,Emil von Behring, 1901, antitoxins,Georeges Kohler and Cesar Milstein, 1984, monoclonal antibody,Susumu Tonegama,1987, structure of Ig gene,Gerald Edelman and Rodney Porter, 1972, structure of antibody,Paul Ehrlich , 1908, production of antibody,Nobel Prize winne

2、rs,抗体药物销售趋势图,1.抗体的结构、分类与功能,抗体是一种蛋白质,抗体由四条蛋白质长短链组成(两长两短)抗体分子上有两个抗原结合区(二者相同)抗体与抗原结合是专一性的(lock & key),Epitope, Antigenic determinant抗原决定簇,一个抗原分子上可能有数个抗原决定簇每个抗原决定簇至少诱生一种专一性抗体蛋白质性抗原决定簇含有六个以上氨基酸,整体水平抗体生成技术,细胞工程抗体生成技术,基因工程抗体生成技术,多克隆抗体（抗血清）,单克隆抗体,嵌合抗体、改形抗体,“小型化抗体”（单链抗体）,组合抗体库技术,噬菌体抗体库技术,指由不同B细胞克隆产生的针对抗原物质中多

3、种抗原决定簇的多种抗体混合物。,多克隆抗体（polyclonal antibody）,传统抗血清,抗 原,免 疫,所有抗体混合,1,2,3,4,脾 脏,淋巴結,B 細胞,传统抗血清的交叉反应,专一性反应,沒有反應,交叉反应,+,-,?,1 2 3 Ag A,x y z Ag B,1 2 0 Ag A,.单克隆抗体,单克隆抗体是将抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而生产的。由于这种抗体是针对一个抗原决定簇的抗体，又是单一的B淋巴细胞克隆产生的，因此称为单克隆抗体。它是结构和特异性完全相同的高纯度抗体。,一个B细胞只能产生一种抗体,对付某一抗原决

4、定簇,若有许多抗原决定簇,则需许多B细胞分别产生抗体,1,2,3,4,单抗,细胞融合,取出脾细胞,+癌细胞,各抗体分开,单克隆抗体技术操作流程,.基因工程抗体,1 人一鼠嵌合抗体(Chimeric Antibodies),人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒定区融合而得到的抗体。,构建嵌合抗体的大致过程是，将鼠源单抗的可变区基因克隆出来，连到包含有人抗体恒定区基因及表达所需的其它元件(如启动子、增强子、选择标记等)的表达载体上，在哺乳动物细胞(如骨髓瘤细胞、CHO细胞)中表达。,构建重组表达载体,克隆鼠单抗的可变区基因，可从基因组文库中分离，也可用PCR技术分离。 人抗体恒定区可根据

5、需要选择，不同的恒定区会带给嵌合抗体不同功能。为避免人抗体的恒定区产生不需要的副作用，可通过点突变来修饰调整其效应。,人一鼠嵌合抗体与鼠单抗相比，免疫原性大大降低，利于在人体内应用，所以目前已制备出上百种抗各种抗原(包括肿瘤相关抗原)的嵌合抗体。,Pr 鼠VH 人 CH Pr 鼠VL 人 CL,免疫球蛋白基因载体的构建,H链嵌合载体,L 链嵌合载体,共转染细胞,启动子,人-鼠嵌合抗体基因工程改造策略,鼠VH,鼠VL,人CL,人CH,抗体分泌细胞,2 鼠单抗可变区的人源化,尽管嵌合抗体的免疫原性已降低很多，但有时它仍可能引发较强的免疫反应。为了进一步降低抗体的鼠源成分，发展出CDR移植技术。 C

6、DR移植即把鼠抗体的CDR序列移植到人抗体的可变区内，所得到的抗体称CDR移植抗体或改型抗体，也就是人源化抗体。,经过CDR移植，抗体的免疫原性极低，而其抗原结合能力保持不变，结合半抗原及全抗原(如细胞表面受体、病毒等)的改形抗体都已有报道，到现在已有数百种人源化抗体。（美国正式上市的11种治疗性单抗中多数是改型抗体）,CDR序列,CDR序列,鼠单克隆抗体,人抗体,人源化抗体（改型抗体）,鼠单克隆V区人源化（CDR移植）,人源化抗体的构建可用全合成法或定点突变法。 全合成法是以人抗体序列为骨架，以鼠抗体的CDR置换人抗体的CDR，将整个可变区序列的两条链分解成若干片段，并使相邻的片段具有彼此互

7、补的粘性末端。合成所有DNA片段，每组片段分别退火，然后逐组连接成完整的可变区基因，插入质粒中，进一步即可用于构建和表达改形抗体。,定点突变法是将人的可变区基因克隆，根据鼠抗体的CDR 序列合成几种突变引物，用定点突变的方法将人的可变区基因的CDR序列变为鼠抗体的CDR序列，然后表达出改型抗体。,研究表明，在构建改形抗体时，简单地进行CDR替换并不能保证抗体具有好的亲和力，因此在构建时还必需包括对影响抗原结合位点的空间结构的框架序列进行操作。,小分子抗体包括Fab、Fv或ScFv、单域抗体及最小识别单位等几种。小分子抗体有很多优点:可以用细菌发酵生产，成本低;分子小，穿透力强;不含Fc，没有F

8、c带来的效应;在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出;易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得免疫毒素或酶标抗体等。,3 小分子抗体,Fv,ScFv,单区抗体,最小识别单位,Fab,由完整的轻链和Fd组成，大小为完整分子的1/3。 把Fab与细菌的前导肽相连，在前导肽的作用下Fab进入质周腔，装配折叠后，它具有结合抗原的活性。,(1)Fab,免疫球蛋白基因载体的构建,H链表达载体,L链表达载体,共转染细胞,Pr VH CH1 Pr VL CL,Fab 抗体分子的制备,抗体分泌细胞,VH,VL,CL,-S-S-,CH1,Fv、ScFv的大小约为全分子的1/6。,(2)Fv 或 ScFv,Fv,S

9、cFv,连接肽,Fv由VH与VL构成，由于其结合是非共价结合，故Fv不稳定。 在VH与VL之间加上一段连接肽，把VH与VL连成一条单链，得到ScFv，即单链抗体。 连接肽的长度在10-15个氨基酸左右，不宜太长或太短，它应具有柔软性，侧链少，抗原性弱等特点。常用的连接肽是(GGGGS)3。,单链抗体的构建在已知亲本DNA序列时可用完全人工合成法; 在具备亲本单抗可变区的cDNA克隆时，可用定点突变法在其两端造成适当的内切酶位点，与人工合成的连接肽编码序列连接，组装到表达载体中; 如果从杂交瘤细胞系构建单链抗体，可用PCR方法扩增可变区基因，再组装到适当的表达载体上。,单链抗体最常用的表达体系是

10、大肠杆菌，有2种方式: 一是表达为包涵或非包涵体的不溶蛋白。产量高，可达细菌蛋白总量的5%-20%，但需进行变性复性，使其形成正确的立体结构，恢复抗体活性; 二是分泌型表达，将细菌的信号肽序列与单链抗体的氨基端相连，单链抗体分子就可分泌到质周腔和细菌体外，进行折叠后成为有活性的分子。但产量不及前者，一般实验室培养条件下每升细菌的产量仅在数毫克左右。,分别构建载体,L链表达载体,H链表达载体,共转染细胞,Pr VH Pr VL,Fv 二硫键稳定的Fv (disulfide-stabilized Fv,ds-Fv)小分子抗体的制备,抗体分泌细胞,disulfide-stabilized Fv,ds

11、-Fv,VH VL,接头DNA (Gly4Ser)3,VH引物,PCR,VH 接头DNA,酶切、克隆,ScFv (single chain Fv,scFv )的构建,变性、复性,VL引物,VL,即为VH，约为完整分子的1/12。它只由一个结构域构成，故称单域抗体。单域抗体尽管亲和力有所降低，但仍保持着原单抗的特异性。,(3)单域抗体,VH,约为完整分子的1/80-1/70大小，一般由一个CDR构成，它也保持着抗体的特异性。,(4)最小识别单位,CDR,4 双特异抗体和多价抗体,双链抗体 （Diabody）一词最早由Hollinger等于1993年创造。乃是一种小分子的双价双特异性抗体片段。,双

12、特异性抗体(bispecific antibody,BSAb)是指能同时识别2种抗原的抗体。1种为对应肿瘤相关抗原。另1种为对应效应成分。 即能结合靶肿瘤细胞又能结合高细胞毒性的效应细胞,将效应细胞富集在肿瘤周围,而且可以模拟天然配体的作用,与细胞表面引发分子结合,激活效应细胞,实现对肿瘤细胞的杀伤和裂解。,Hollinger等巧妙地将抗原抗体的轻链可变区基因(VLA)与抗抗原抗体的重链可变区(VHB)通过短肽连接子连接;同样地,将VHA与VLB连接,将两组嵌合基因置于双顺反子的表达质粒中,构建成双链抗体的表达质粒,目前报道的表达质粒均为双顺反子。表达后,VLA VHB与VHA VLB交叉连结

13、,形成双特异性抗体。,所以双特异性抗体与既往肿瘤免疫治疗相比,除了能特异性识别肿瘤细胞外,还能将循环血液中的免疫效应细胞再导向至肿瘤细胞处,从而使效应细胞的抗肿瘤活性增强,发挥免疫导向作用,这是肿瘤治疗的新突破。,抗体库技术是用基因工程方法把人或其他动物的全部抗体的轻、重链可变区基因克隆出来，在原核载体上表达，然后筛选出所需的特异基因和抗体。主要有以下两种技术：免疫球蛋白Fab片段在大肠杆菌中的成功表达 噬菌体表面展示文库技术,5 抗体库技术,初期的抗体库技术是从淋巴细胞中提取总RNA，反转录成cDNA或直接用总DNA为模板，用PCR技术建立轻、重链文库，在大肠杆菌中表达后筛选。,它是在PCR

14、技术和Phage Display的基础上实现的。其过程是把用PCR法得到的抗体基因插入丝状噬菌体的DNA，与噬菌体外壳蛋白的基因相连，在辅助噬菌体的帮助下，噬菌粒包装成丝状噬菌体，抗体分子通过与P 或P相连，在噬菌体表面的一端或分散分布，然后可直接对噬菌体表面的抗体分子进行筛选。,噬菌体抗体库技术,噬菌体表面展示系统(phage surface display system ),噬菌体展示技术是将各种多肽或蛋白质以融合蛋白的形式表达并展示在噬菌体表面，同时将其遗传密码包含于噬菌体内部，这使得蛋白质的功能与其基因密码有机的连结在一起。,非展示系统 展示系统,噬菌体抗体库的构建,Hinge,(Fa

15、b)2,Fab,Fc,MembraneExtension,C,L,C,H1,Fv,Fv,scFv,Single Chain Fragment variable,单克隆抗体 噬菌体抗体 杂交瘤技术 展示技术,宿主细胞: 杂交瘤 细菌筛选范围 : 103 107109时间: 几个月 几周操作: 繁杂 相对简单免疫: 必须 可避免人源抗体: +费用: 高 低生产量: 有限 无限基因获取: 再克隆 直接应用前景: 有限 不可估,噬菌体抗体库的选择过程,B,B,B,B,B,B,Immunotubecoated withantigen,coated withsteptavidin and biotinyl

16、ated antigen,B,biotin,antigen,Solution phase selection with biotinylated antigen,Bind to Streptavidin,coated microtitre wells,Wash to remove unbound phage particles.,Elute bound phage,Amplify eluted phageRepeat selectionAnalyzea) ELISAb) Specificityc) Sequencingd) Affinitye) Activity,E.coli,感染和扩增,噬菌

17、体展示技术最关键的优势有三：淘选的高效率使得在极低的存在 水平下，挑选到高亲和力噬菌体成为可能；所挑选到的噬菌体可在微量存在的情况下，通过感染细菌得到富集；展示的多肽或蛋白质与其包含在噬菌体内部的基因密码的连接，使得结合肽或蛋白质的序列分析既快速又简便。,噬菌体（M13, T7, T4, ) 病毒（反转录病毒，杆状病毒）表面展示系统 细菌（葡萄球菌，E. Coli) 酵母 体外共价连接（蛋白DNA, 蛋白RNA),噬菌体展示技术的应用现状,抗体： 抗狂犬病毒的单链抗体， 抗HIV-1囊膜糖蛋白的单链抗体，此抗体可专一性杀死被HIV-1感染并表达有gp120的淋巴细胞, 中和响尾蛇毒素的单链抗，

18、 等等。,2.疫苗： 展示在噬菌体表面的HIV-1 的gp120-V3环可 象天然抗原一样引起显著的免疫应答3.酶： 例：碱性磷酸酶，蛋白水解酶类，4.底物与抑制剂： 主要是蛋白酶的底物和其抑制剂。,5. 多肽类药物：如一些激动剂或拮抗剂从多肽库中分离鉴定出来；已获得一13 肽，它能中和蛇毒 ；从CX7C 多肽库中掏选到一个多肽能与 Hantavirus 结合，并使该病毒不能结合或感染细胞。人血管促生素是一种能促进肿瘤血管生长的蛋白，用这个蛋白去淘选一个噬菌体展示多肽库，所获得的一个环状8肽能与血管促生素结合，并能阻遏血管促生素的活性,6. 肿瘤药物导航载体：用肿瘤细胞特殊的受体蛋白从展示文库

19、中淘选到的多肽或单链抗体，可以作为抗癌药物的定向输送工具 。一个成功的实例是：将噬菌体多肽展示库注射入具有肿瘤的小鼠体内，然后杀死小鼠，取出肿瘤，再将结合其上的噬菌体洗脱下来。展示在其上的多肽具有与该肿瘤的特异性亲和力。将此多肽与细胞毒素 doxorubicin 偶联。结果显示，此偶联物具有更强的抑制肿瘤的效果.,7. 信息传递研究: 利用噬菌体展示多肽库，发现了一些受体，如凝血致活酶、黑皮质素受体、CD80 和一个 Hantaviral 受体；受体的配体， 如血管促生素、 -bungarotoxin， 和一些大蛋白分子中的折叠区域，如SH2、SH3 和 WW 区域。从多肽库中可分离到与天然激

20、素相似的、与受体结合的高亲和力的多肽, 因此用完整细胞可以从多肽库中找到受体的高选择性配体。在不知道任何有关的受体和配体信息的情况下，用完整细胞和组织或动物，可筛选到特异与靶组织结合的多肽和蛋白。,8.DNA结合蛋白：锌指蛋白是一类 DNA 结合小肽结构物，这些结构含有锌，能用于构建一个大的蛋白区域，去识别和结合特殊的 DNA 序列。噬菌体展示技术也可以用于创造一个大的、具有识别不同 DNA 序列的 锌指的多肽库。利用这个多肽库，可以研究有关氨基酸序列与 DNA 结合位点之间的识别规则，可以通过设计 锌指多肽去控制基因的表达，比如抑制小鼠细胞系中的癌基因，也可以启动表达质粒的基因，或干扰病毒感染生活周期。,9.蛋白质组学：噬菌体展示技术作为一个多肽和蛋白质合成的工具箱，使得任何蛋白均能找到与其有特异结合力的多肽和蛋白质，其构建的文库的滴度可达1012。蛋白质组学的基本点就是利用蛋白质-蛋白质的相互作用，对成千上万种蛋白质同时进行分析。而噬菌体展示技术正好能符合这种要求。例：将噬菌体展示cDNA 文库制成蛋白点阵，成功的应用于寻找与过敏症有关的蛋白质。,